分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用

分子生物學(xué)技術(shù)在昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用摘要：分子牛物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究，是50年代末新興起來(lái)的，近年來(lái)發(fā)展相當(dāng)迅速。為了把握這個(gè)研究方向，并促進(jìn)這個(gè)研究領(lǐng)域的發(fā)展，作者從研究方法、研究?jī)?nèi)容、研究對(duì)象等方面著手，近10年來(lái)分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)，并對(duì)其的研究進(jìn)展進(jìn)行了概括和總結(jié)。介紹了DNA序列測(cè)定、RFLP、分子雜交技術(shù)、RAPD、SSC及DSCP等幾種主要方法及其應(yīng)用情況，并從分類鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析、分子進(jìn)化、遺傳變異及進(jìn)化研究等方而總結(jié)了已有的研究成果，日前已進(jìn)行過(guò)分子系統(tǒng)發(fā)育研究的昆蟲(chóng)類樣進(jìn)行了列表總結(jié)。關(guān)鍵詞：分子生物學(xué)技術(shù)；昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué).PERSPECTIVEOFMOLECULARBIOLOGICALTECHNIQUESAPPLIEDININSECTSYSTEMATICSAbstract：Anewareaofentomologicalscienceformsasmolecularbiologicaltechniqueswereappliedininsectsystematics.Sinceitscommencementin1980's,muchimportantprogresshasbeenmadeandmanyexcellentresultshavebeenachievedespeciallyinrecentfewyears.Inordertohaveagoodperspectiveonthisnewarea,thispaperfocusesonthemainthemesandmethodsincludedinthisarea,andgivesanoutlinetotheprogressintherecent10years.ThemethodsmainlyusedinthisareaincludeDNAsequencing,RFLP,molecularridization,RAPD,SSCPandDSC，whicharediscussedinthepaper.Theirapplicationsintaxonomyandidentificationofspecies,phylogenyreconstruction,molecularevolution，populationecologyandevolution,aresumma-rued.Thereisalsoalistofinsectgroupswhichhavebeenstudiedinmolecularsystematics.Keywords：molecularbiologicaltechnique；insectsystematics前言：本世紀(jì)70年代，由于限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn),DNA重組技術(shù)的建立,DNA序列快速測(cè)定方法的發(fā)明，分子生物學(xué)及其技術(shù)以迅猛的速度發(fā)展。80年代，PCR技術(shù)的產(chǎn)生和發(fā)展，加速了分子生物學(xué)技術(shù)在生物學(xué)各研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)學(xué)研究中，始于本世紀(jì)80年代末，近些年來(lái)發(fā)展迅速，通過(guò)研究昆蟲(chóng)核酸分子的結(jié)構(gòu)來(lái)探求各類群之間的親緣和進(jìn)化關(guān)系，從生命的本質(zhì)上子找昆蟲(chóng)各類群之間的內(nèi)在聯(lián)系。作者從研究方法、研究?jī)?nèi)容及研究對(duì)象二方面對(duì)近10年來(lái)昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)的研究進(jìn)展作簡(jiǎn)要的綜述。正文：1研究方法前用于昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)研究的卞要方法有核酸序列分析(DNAsequenceanalysis)、RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析，Restrictionfragmentlengthpolymorphism)、分子雜交技術(shù)(Molecularhybridization),RAPD(隨機(jī)擴(kuò)增DNA多態(tài)性分析，RandomamplifiedpolymorphicDNAI),SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性，Singlestrandconformationalpolymorphism)和DSCP（鏈構(gòu)象多態(tài)性，Doublestrandconformationalpolymorphism)分析等方法[1]。1.1DNA序列分析DNA序列分析是通過(guò)直接比較不同類群個(gè)體同源核酸的核茸酸排列順序，構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并推斷類群間的系統(tǒng)演化關(guān)系、最可靠的方法。但序列分析耗資較大，也很費(fèi)時(shí)，所以不適[2]宜于大群體的遺傳進(jìn)化研究。但隨著生物技術(shù)的不斷提高，藥品、試劑盒及酶制劑越來(lái)越廉價(jià)，此方法將會(huì)得到廣泛應(yīng)用。此方法與RFLP及DSCP等其它方法相結(jié)合，可快速而經(jīng)濟(jì)地測(cè)定大量個(gè)體，此乃今后發(fā)展的方向[2]。日前已對(duì)許多昆蟲(chóng)核基因組中的核糖體DNA(rDNA)及線粒體DNA(mtDNA)進(jìn)行了序列測(cè)定，并進(jìn)行了相應(yīng)的系統(tǒng)發(fā)育分析。1.2RFLP分析RFLP是應(yīng)用限制性內(nèi)切酶切割不同類群個(gè)體的基因組DNA或某一基因，產(chǎn)生不同長(zhǎng)度的限制性片段，根據(jù)酶切圖，計(jì)算類群之間的遺傳距離，構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。此方法的優(yōu)點(diǎn)是快速·經(jīng)濟(jì)、簡(jiǎn)便，而A結(jié)果也比較可靠，因此特別適合大群體的遺傳、進(jìn)化研究。通常用于RFLP研究的是線粒體基因組DNA(mtDNA，因?yàn)槔ハx(chóng)的mtDNA較小，基因結(jié)構(gòu)較清楚，用限制性內(nèi)切酶切割后可直接進(jìn)行分析。而昆蟲(chóng)核基因組DNA復(fù)雜，酶切后片段很多，很難確定其同源性，擊進(jìn)行分子雜交后才能分析，所以用mtDNA進(jìn)行RFLP分析的研究較多。目前，也有采用RFLP與PCB相結(jié)合的方法，先選用特定引物將某一片段進(jìn)行PCB擴(kuò)增和克隆，然后再進(jìn)行RFLP分析。但RFLP分析遠(yuǎn)不如核酸序列分析提供的信息量多，而且結(jié)果也不如后者可靠，所以，RFLP通常只用于種類鑒定或種內(nèi)種群間的遺傳進(jìn)化研究，很少用于種上階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。1.3分子雜交技術(shù)分子雜交的基本原理是具有一定同源性的兩條核酸單鏈，在一定的條件下可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈，雜交過(guò)程是高度特異性的。用于雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和探針。用帶有標(biāo)記的已知核茸酸片段作為探針，來(lái)檢測(cè)目的基因或DNA片段的存在及變異情況。此方法用于昆蟲(chóng)近緣種和復(fù)合種的鑒定效果較好。但此方法要求對(duì)研究類群的遺傳背景有一定的了解，而目探針的制備也較麻煩，因此，探針雜交技術(shù)應(yīng)用并不廣泛，通常只用于小型醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)的種類鑒定。1.4RAPDRAPD是在PCB基礎(chǔ)上，采用單個(gè)人工合成的隨機(jī)引物(一般為10bp)對(duì)基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所用引物G+C含量在50%一70%之間[3]。此方法的優(yōu)點(diǎn)是:a.快速、簡(jiǎn)便，整個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)茉?4h以內(nèi)完成，而目只擊具備分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基本條件就可進(jìn)行，也尤擊昂貴的試劑及儀器設(shè)備;b.反應(yīng)靈敏;c.對(duì)遺傳背景不清楚的材料也能進(jìn)行。此方法的缺點(diǎn)是:反應(yīng)過(guò)于靈敏，極易受外源DNA的污染，可貢復(fù)性低。在昆蟲(chóng)中，最早由Black等將此方法應(yīng)用于4種蚜蟲(chóng)的鑒定比較，根據(jù)電泳圖r,能明確區(qū)別4個(gè)種[4]。同時(shí)，還檢測(cè)了種內(nèi)不同生物型、同一生物型內(nèi)不同個(gè)體，以及同一種群內(nèi)不同個(gè)體之間擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。此外，還用RAPI)技術(shù)檢測(cè)和鑒定了蚜蟲(chóng)體內(nèi)的兩種寄生蜂。Kambhampti等采用RAPI技術(shù)對(duì)蚊蟲(chóng)的種和種群進(jìn)行了鑒定和區(qū)分，并對(duì)RAPI的實(shí)驗(yàn)技術(shù)、統(tǒng)計(jì)分析及應(yīng)用等進(jìn)行了探討。其后，RAPI在按蚊、寄生蜂、舞毒蛾、粉虱、蚜蟲(chóng)、蝗蟲(chóng)、果蠅等昆蟲(chóng)中均有應(yīng)用。在這些研究中，RAPI大多用于近緣種、復(fù)合種和種內(nèi)生物型的識(shí)別和鑒定，以及地理種群的遺傳進(jìn)化研究。RAPI在系統(tǒng)發(fā)育分析上的應(yīng)用，還有一定的爭(zhēng)論，例如，VanlerbergheMesutti采用RAPI的方法成功地對(duì)膜翅b紋翅卵蜂科的種類進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，但Zande將RAPD應(yīng)用于果蠅種間的系統(tǒng)發(fā)育分析時(shí)，卻得出相反的結(jié)論，認(rèn)為RAPD尤法得到可靠的遺傳距離先要計(jì)算出分類單元間的遺傳距離，遺傳距離的算法以Jukes的單參數(shù)法和Kimura的雙參數(shù)法較為常用。在獲取距離距陣后，按一定的規(guī)則，根據(jù)各距離值間的內(nèi)在關(guān)系構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)。距離法構(gòu)建樹(shù)的方法有多種，影響最大的是Saitou的鄰接法Sneath的不加權(quán)對(duì)群分析法(Unweightedpairgroupwithmathematicalaverage,UPGMA)。距離法適合于分析各種方法獲得的分子數(shù)據(jù)如序列測(cè)定,RFLP,RAPD等。似然法首先擊要確定一個(gè)序列進(jìn)化的模型，如Kimura的雙參數(shù)模型等，然后淤找在該進(jìn)化模型下最有可能產(chǎn)生所研究的DNA序列數(shù)據(jù)的系統(tǒng)樹(shù)，由于這類方法計(jì)算特別復(fù)雜費(fèi)時(shí)，因此其應(yīng)用不如前兩類方法普遍。在似然法中，影響最大的是最大似然法(Maximumlikelihoodmethod)。以上3類方法都是在一定的前提條件下進(jìn)行的，因而有一定的運(yùn)用范圍，由于作者對(duì)許多條件所知甚微，因而很難判斷在某一具體情況下哪種方法最佳。最好是同時(shí)合用多類方法構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，若多種方法所獲系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)一致，將大大提高結(jié)果的可靠性目前用于分子系統(tǒng)發(fā)育分析的主要常用軟件有:MacClade，Phylip，Mega。2研究?jī)?nèi)容2.1種群遺傳變異及進(jìn)化的研究檢測(cè)和描述種內(nèi)各種群的遺傳結(jié)構(gòu)及變異狀況，探討物種的形成與分化的內(nèi)在機(jī)理。內(nèi)容包括自然地理種群及社會(huì)性昆蟲(chóng)的社會(huì)種群研究。通常采用的方法有RAPD,RFLP,SSCP和DSCP，而DNA序列測(cè)定用于種群研究較少。此方面的研究有:Chapco等采用RAPI對(duì)蝗蟲(chóng)種群的研究;Kambhampti等、BallingerGrabtree等采用RAPI檢測(cè)按蚊的亞種及種群變異;陳燕茹等采用RAPI分析果蠅的地理種群變異;土文等、賈振宇等用mtDNA的RFLP方法分析果蠅的自然種群;Martinez等研究mtDNA在蚜蟲(chóng)地理種群內(nèi)的變異;McLain等分析按蚊地理種群中rDNANTS片段的變異;Pnterka等采用RAPDPCB分析蚜蟲(chóng)種群的遺傳變異;Atkinson等采用mtDNA的DSCP方法分析社會(huì)性昆蟲(chóng)種群的遺傳變異[5]。2.2種及種下階元的分類鑒定主要是對(duì)近緣種和復(fù)合種、種下亞種與生物型的識(shí)別和鑒定。此研究最為可靠的方法是分子雜交技術(shù)，在醫(yī)學(xué)昆蟲(chóng)的研究中應(yīng)用較多，如用DNA探針鑒定按蚊復(fù)合種。采用RAPD、RFLP及SSCP,DSCP也能進(jìn)行種類鑒定，Black等采用RAPI技術(shù)成功地檢測(cè)了蚜蟲(chóng)的種及種內(nèi)不同的生物型以及蚜蟲(chóng)體內(nèi)的寄生蜂;VanlerbergheMesutti用mtDNA的RFLP、RAPI分子標(biāo)記有效地鑒定膜翅b寄生蜂種類;Boge等采用PCBSSCP對(duì)步甲種類進(jìn)行了鑒定。2.3系統(tǒng)發(fā)育分析系統(tǒng)發(fā)育分析是系統(tǒng)學(xué)研究的熱點(diǎn)，通過(guò)分子系統(tǒng)發(fā)育研究，對(duì)傳統(tǒng)分類有疑問(wèn)的類群或形態(tài)分類不能解決的類群的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)行分析和探討，也可對(duì)傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)進(jìn)行驗(yàn)證。分子系統(tǒng)發(fā)育研究采用的數(shù)據(jù)通常是DNA序列，RFLP數(shù)據(jù)也可用于低級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析[6]。目前已有許多類群進(jìn)行了分子系統(tǒng)發(fā)育分析，從種級(jí)至目級(jí)階元都有研究。分子系統(tǒng)學(xué)研究結(jié)果與傳統(tǒng)的分類系統(tǒng)及形態(tài)支序分析的結(jié)果有的相一致，但有的卻很矛盾，如Camp-bell等Dohlen等根據(jù)18SrDNA片段序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹(shù)證明:同翅目并非為一個(gè)單系群，而是一個(gè)平行進(jìn)化的類群。Chalwatzis等、Whiting等根據(jù)18S和28SrDNA的序列分析，證明捻翅目與雙翅目親緣關(guān)系較近，而與鞘翅目關(guān)系卻較遠(yuǎn)，而傳統(tǒng)分類學(xué)一直認(rèn)為捻翅目與鞘翅目關(guān)系較近，有的學(xué)者并把它作為鞘翅目中的一個(gè)總科。這樣，分子數(shù)據(jù)與形態(tài)數(shù)據(jù)結(jié)果不統(tǒng)一，在現(xiàn)有研究水平下很難說(shuō)哪種方法得出的結(jié)論更可靠，目前較為折中的辦法是把分子性狀和形態(tài)性狀綜合起來(lái)分析2.4分子進(jìn)化。分子進(jìn)化的研究目的是構(gòu)建基因或DNA分子的進(jìn)化樹(shù)，并探索生物大分子的進(jìn)化機(jī)制和特征。這類研究卞要集中在親緣關(guān)系比較明確的類群或高級(jí)階元類群之間進(jìn)行，研究對(duì)象以rDNA及mtDNA為主要研究對(duì)象。3研究結(jié)論3.1rDNArDNA是編碼核糖體RNA的基因，是一類中度重復(fù)的DNA序列，以串聯(lián)多拷貝形存在于染色體DNA中，每個(gè)重復(fù)單位由非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(norrtranscribedspacer,NTS)、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internaltranscribedspacer,ITS)。3種RNA(18S,5.8S,28SrRNA)基因編碼區(qū)組成rDNA3個(gè)區(qū)域的DNA進(jìn)化速率各有不同，編碼區(qū)總的來(lái)說(shuō)，進(jìn)化速率很慢，非常保守，適合于構(gòu)建生命系統(tǒng)樹(shù)的基部分支，但編碼區(qū)內(nèi)，又可分為高度保守區(qū)、保守區(qū)、可變區(qū)和高變區(qū)，這些不同的區(qū)域，適合于不同階元類群的系統(tǒng)發(fā)育研究;轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)為中度保守，適合于推斷5-10年左右的進(jìn)化事件;非轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)則進(jìn)化速度較快，適合于種間關(guān)系的研究[7]。由于rDNA是生物界普遍存在的遺傳結(jié)構(gòu)，具有多拷貝性及上述種種優(yōu)點(diǎn)，因而在個(gè)體及群體內(nèi)有較好的均一性，少量樣品能有效代表其來(lái)源群體的rDNA的變異情況。因此，rDNA已成為生物系統(tǒng)進(jìn)化研究中一個(gè)非常有用的分子標(biāo)記。自Hillis最先將rDNA用于系統(tǒng)發(fā)育分析之后，rDNA在不少昆蟲(chóng)類群的系統(tǒng)進(jìn)化和分類研究中已得到廣泛的應(yīng)用。其中，編碼18S和28SrRNA的基因片段用于系統(tǒng)發(fā)育研究較多，常用于科級(jí)以上水平的系統(tǒng)發(fā)育分析,高可變區(qū)序列也可用于屬級(jí)或種級(jí)水平的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究。編碼5.8SrRNA的基因片段由于太短，一般很少單獨(dú)使用。Wesson等首先開(kāi)始蚊子的ITS片段比較研究，其后Campbell等將ITS片段用于膜翅b金小蜂科復(fù)合種的系統(tǒng)發(fā)育分析,Porter等及Paskewitz等分別將ITS片段用于雙翅目按蚊科復(fù)合種的系統(tǒng)發(fā)育分析中,Kuperus等用ITS進(jìn)行蝗科蚌蛻亞科的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析[8]。3.2mtDNA 線粒體DNA(mitochondrialDNAmtDNA)為雙鏈閉環(huán)分子，昆蟲(chóng)的線粒體DNA大小為15.4-16.3kb左右，其中含有編碼2個(gè)核糖體RNA(12SrRNA人16SrRNA),22個(gè)tRNA,1個(gè)細(xì)胞色素b，3個(gè)細(xì)胞色素氧化,6個(gè)NADH降解和2個(gè)ATP酶的基因[9]。由于線粒體DNA在分子進(jìn)化中有許多獨(dú)特的優(yōu)越性:mtDNA的提取類似于質(zhì)粒，相對(duì)于核基因的分離較為容易，基因組小，具高拷貝數(shù)目;基因組中不含間隔區(qū)和內(nèi)含子，重復(fù)序列，在遺傳過(guò)程中不發(fā)生基因重組、倒位、易位等突變;遺傳過(guò)程中遵守嚴(yán)格的母系遺傳方式，從而避免了雙親遺傳方式引起的隨機(jī)性;而目，雖然線粒體基因組的基因排列順序高度保守，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但mtDNA序列的取代速率卻比核DNA高5-10倍，因此，由于以上結(jié)構(gòu)和進(jìn)化上的特點(diǎn)，mtDNA已成為研究進(jìn)化的貢要材料。最先用mtDNA的基因?qū)ハx(chóng)綱10個(gè)進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，其后不少學(xué)者采用mtDNA對(duì)昆蟲(chóng)不同階元類群進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，研究范圍從種內(nèi)種群之間至高級(jí)階元之間的系統(tǒng)發(fā)育分析均有。通常用于系統(tǒng)發(fā)育分析的基因是16SrRNA，其它基因也有應(yīng)用，尤其是控制區(qū)(A-T豐富區(qū))已開(kāi)始受到重視。3.3其它基因利用rDNA或mtDNA基因進(jìn)行系統(tǒng)學(xué)研究，擁有技術(shù)條件優(yōu)勢(shì)，并有適用于分類學(xué)大范圍使用的PCB保守引物可利用，還有前人研究的大量數(shù)據(jù)也可利用，因此，大多數(shù)分子系統(tǒng)發(fā)育研究都采用rDNA或mtDNA的基因。但兩者也有不足:mtDNA由于堿基組成的偏愛(ài)及沉默位點(diǎn)(silentsites)的多替代，所以mtDNA較少用于較高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析;而rDNA基因則排序較為困難。因此，有的學(xué)者試圖子找能更好地用于昆蟲(chóng)分子系統(tǒng)學(xué)研究的新基因c編碼核蛋白的基因(Nuclearproteincodinggenes)具有易于排定、能明確確定迅速進(jìn)化位點(diǎn)，而目在選擇適當(dāng)進(jìn)化速率的適合某一系統(tǒng)學(xué)問(wèn)題的基因上具有靈活性，因此目前已經(jīng)有一些編碼核蛋白的基因被應(yīng)用于昆蟲(chóng)的系統(tǒng)發(fā)育分析中[10]。Soto-Adames等用葡萄糖，6-磷酸脫氫酶基因(glucose6-phosphatedehydrogenasegene,G6pdh)研究12種昆蟲(chóng)，結(jié)果表明Gbpdh基因用于屬或目級(jí)水平的系統(tǒng)發(fā)育研究是很有用的，但不能用于近緣種的系統(tǒng)發(fā)育分析。而B(niǎo)egum卻用Gbpdh研究果蠅的地理種群分化。Russo等用乙醇脫氫酶基因(alcoholdehydrogenasegene,Adh)研究果蠅及其相關(guān)屬的系統(tǒng)發(fā)育分析。Cho等Mitchell等用延長(zhǎng)因子基因分析鱗翅目夜蛾類的系統(tǒng)發(fā)育。Danforth等研究蜜蜂了EF-la,認(rèn)為它是一個(gè)用于昆蟲(chóng)系統(tǒng)發(fā)育分析的很好的基因。Friedlander等將磷酸烯醇內(nèi)酮酸梭激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase)基因用于鱗翅b高級(jí)階元的系統(tǒng)發(fā)育分析。綜上所述，編碼核蛋白的基因用