pcr技術(shù)課件簡短

pcr技術(shù)課件ppt簡短pcr技術(shù)簡介pcr技術(shù)的基本步驟pcr技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程pcr技術(shù)的注意事項(xiàng)pcr技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)contents目錄pcr技術(shù)簡介01CATALOGUE核酸變性引物與DNA的結(jié)合產(chǎn)物分析循環(huán)延伸核酸分離和純化pcr技術(shù)的基本原理1983年由KaryMullis發(fā)明，應(yīng)用熱循環(huán)技術(shù)實(shí)現(xiàn)DNA的指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。基礎(chǔ)PCR1993年，DavidR.Higuchi在TaqMan的基礎(chǔ)上開發(fā)出實(shí)時(shí)PCR技術(shù)，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程。實(shí)時(shí)PCR1995年，LaryK可通過多重PCR同時(shí)檢測多個(gè)基因位點(diǎn)。多重PCR2001年，ABIPRISM3700DNAAnalyzer推出，實(shí)現(xiàn)了高通量PCR檢測。高通量PCRpcr技術(shù)的發(fā)展歷程基因克隆、基因表達(dá)、基因組測序、單核苷酸多態(tài)性(SNP)檢測等?；A(chǔ)研究醫(yī)學(xué)診斷生物多樣性研究感染性疾病、遺傳性疾病、腫瘤等疾病的診斷。物種鑒定、種群遺傳學(xué)分析、生態(tài)學(xué)研究等。030201pcr技術(shù)的應(yīng)用范圍pcr技術(shù)的基本步驟02CATALOGUE選擇合適的樣本類型，如血液、組織等，以便后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。樣本類型采集樣本時(shí)需遵循無菌操作原則，確保樣本質(zhì)量。樣本采集存儲(chǔ)樣本時(shí)需選擇適當(dāng)?shù)拇鎯?chǔ)方式，以保持樣本的穩(wěn)定性。樣本存儲(chǔ)樣本準(zhǔn)備通過化學(xué)或物理方法裂解細(xì)胞，釋放出基因組DNA。細(xì)胞裂解采用特殊的緩沖液和洗滌劑去除雜質(zhì)，純化DNA。DNA純化通過電泳或紫外分光光度法檢測DNA質(zhì)量，確保其純度和濃度符合要求。DNA質(zhì)量檢測基因組DNA的提取循環(huán)擴(kuò)增反復(fù)進(jìn)行變性、引物結(jié)合和DNA合成步驟，使目標(biāo)基因片段得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。DNA合成在DNA聚合酶的作用下，按照模板DNA序列合成新的DNA片段。引物結(jié)合引物與DNA模板結(jié)合，為后續(xù)的DNA合成提供起始點(diǎn)。引物設(shè)計(jì)根據(jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以便擴(kuò)增出目標(biāo)基因片段。DNA變性加熱使DNA雙鏈解開，暴露出堿基對(duì)。pcr擴(kuò)增熒光定量PCR利用熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析，測定目標(biāo)基因片段的拷貝數(shù)或相對(duì)表達(dá)量。電泳分析將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)遷移率判斷目標(biāo)基因片段的大小和純度。序列分析對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確定目標(biāo)基因序列是否與參考基因序列一致。產(chǎn)物檢測和分析pcr技術(shù)的實(shí)驗(yàn)流程03CATALOGUE明確實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和檢測樣本，如臨床樣本、環(huán)境樣本等。確定實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮蜆颖靖鶕?jù)目標(biāo)基因序列設(shè)計(jì)PCR引物。設(shè)計(jì)引物確定反應(yīng)體系中所需的試劑和濃度。選擇合適的PCR反應(yīng)體系根據(jù)目標(biāo)基因序列和引物組合設(shè)定PCR儀的反應(yīng)程序。設(shè)定PCR儀的反應(yīng)程序?qū)嶒?yàn)前準(zhǔn)備提取、純化樣本DNA，去除雜質(zhì)和干擾。樣本處理構(gòu)建PCR反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測和分析將DNA模板、引物、dNTPs、酶等試劑加入PCR反應(yīng)管中。將PCR反應(yīng)管放入PCR儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。收集PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行電泳分析或熒光定量PCR等檢測方法，確定目標(biāo)基因序列是否被成功擴(kuò)增。操作步驟引物和反應(yīng)體系的優(yōu)化根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)引物和反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，提高PCR擴(kuò)增效率和特異性。樣品處理和儲(chǔ)存對(duì)使用過的樣本進(jìn)行妥善處理，并儲(chǔ)存未使用的樣本以備后續(xù)使用。數(shù)據(jù)分析和結(jié)論對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，得出結(jié)論。實(shí)驗(yàn)后處理pcr技術(shù)的注意事項(xiàng)04CATALOGUE明確實(shí)驗(yàn)的目的和預(yù)期結(jié)果，并熟悉PCR儀的使用步驟。確認(rèn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒襟E根據(jù)目的基因序列，選擇特異性好、擴(kuò)增效率高的引物。選擇合適的引物確保使用的模板DNA無降解、無污染，濃度和純度適中。確認(rèn)模板DNA的質(zhì)量根據(jù)引物、模板和PCR儀的規(guī)格，設(shè)置合理的反應(yīng)體系。設(shè)置合理的反應(yīng)體系實(shí)驗(yàn)前的注意事項(xiàng)控制好反應(yīng)溫度和時(shí)間PCR反應(yīng)中，每個(gè)溫度點(diǎn)的反應(yīng)時(shí)間和升溫/降溫速度應(yīng)保持一致。避免出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增通過優(yōu)化反應(yīng)條件和引物設(shè)計(jì)，減少非特異性擴(kuò)增的產(chǎn)生。注意觀察熒光信號(hào)的變化在實(shí)時(shí)PCR過程中，密切觀察熒光信號(hào)的變化，確保反應(yīng)正常進(jìn)行。避免樣品交叉污染每次實(shí)驗(yàn)前，徹底清洗PCR儀和管路，避免樣品間的交叉污染。實(shí)驗(yàn)中的注意事項(xiàng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，進(jìn)行定量和定性分析，并處理異常值。數(shù)據(jù)分析與處理將用過的引物和模板妥善儲(chǔ)存，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。引物和模板的儲(chǔ)存定期對(duì)PCR儀進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，確保設(shè)備的正常運(yùn)行。儀器的維護(hù)與保養(yǎng)實(shí)驗(yàn)后的注意事項(xiàng)pcr技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)05CATALOGUE靈敏度高特異性強(qiáng)操作簡便應(yīng)用廣泛優(yōu)點(diǎn)01020304PCR技術(shù)可以檢測出微量的DNA，靈敏度非常高。通過設(shè)計(jì)特異性的引物，PCR技術(shù)可以特異地?cái)U(kuò)增目標(biāo)DNA片段，不擴(kuò)增其他非目標(biāo)DNA。PCR技術(shù)流程相對(duì)固定，操作相對(duì)簡單，易于標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。PCR技術(shù)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、基因組學(xué)等領(lǐng)域。PCR技術(shù)需要使用大量的DNA模板，容易造成實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的交叉污染，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。容易污染PCR技術(shù)需要精密的儀器設(shè)備，如PCR儀、電泳儀等，設(shè)備成本較高。對(duì)設(shè)備要求高PCR技術(shù)需要已知目標(biāo)DNA序列，才能設(shè)計(jì)特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增。只能擴(kuò)增已知序列PCR技術(shù)需要進(jìn)行多輪反應(yīng)才能獲得足夠的DNA片段，實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長。實(shí)驗(yàn)耗時(shí)長01030204缺點(diǎn)采用自動(dòng)化設(shè)備采用自動(dòng)化設(shè)備可以減少人為操作失誤，提高實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性。應(yīng)用新技術(shù)結(jié)合其他新技術(shù)如納米孔測序、