生化分析實(shí)驗課紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)吸收光譜曲線

紫外分光光度法

測定蛋白質(zhì)吸收光譜曲線一實(shí)驗原理

蛋白質(zhì)所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生π→π﹡及n→π﹡類型的電子躍遷，因此能夠在近紫外光區(qū)產(chǎn)生光吸收，并且在280nm波長處有一特征吸收峰。利用這一特性，通過對蛋白質(zhì)紫外吸收光譜曲線的測定，可以進(jìn)行定性分析。二實(shí)驗?zāi)康呐c要求（1）、了解紫外分光光度儀的基本原理和使用方法。

（2）、學(xué)習(xí)和掌握紫外吸收光譜曲線的制作方法。

（3）、了解和掌握蛋白質(zhì)的定性原理。三實(shí)驗主要儀器與器材

3-1、實(shí)驗儀器

（1）、紫外分光光度儀

（2）、混合器

（3）、天平3-2、實(shí)驗器材（1）、定容瓶（2）、燒杯（3）、滴管（4）、骨勺（5）、稱量紙（6）、剪刀（7）、鑷子（8）、洗瓶（9）、玻棒（10）、記號筆（11）、標(biāo)簽紙（12）、坐標(biāo)紙四試劑及配制4-1牛血清白蛋白

[試劑純,上海試劑有限責(zé)任公司]

牛血清白蛋白溶液的配制（1.0毫克/毫升）：

稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加適量蒸餾水將其溶解，然后補(bǔ)加蒸餾水定容至刻度，混勻后即濃度為1.0毫克/毫升的溶液。

五操作步驟與結(jié)果

5-1、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線的測定

采用2只光徑1.0厘米潔凈的石英比色杯，分別倒入蒸餾水4.0毫升和牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸餾水（或溶劑）為空白溶液，調(diào)儀器零點(diǎn)（具體方法詳見儀器操作說明書）。標(biāo)準(zhǔn)品或測試樣品溶液在250—300nm波長的范圍內(nèi)，以每間隔5個nm波長依次測定，同時記錄各波長蛋白質(zhì)溶液的吸光值于表1

中（結(jié)果見表1）。在每次更換測定波長時均需要重新調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)后，方能測定。對測定波長的范圍和間隔大小，可根據(jù)不同樣品的實(shí)際情況和要求加以確定。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液在不同波長測定結(jié)果

表1-牛血清白蛋白樣品溶液在250—300nm波長吸光度結(jié)果表波長（nm）

250.0255.0260.0265.0270.0275.0277.5吸光度(A)

波長（nm）

280.0282.5285.0290.0295.0300.0305.0吸光度(A)

5-2、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線的制作

以表1測定的波長為橫坐標(biāo)，相對應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)對應(yīng)作圖。然后分別將圖中各點(diǎn)用線連起來，即得到蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線，其中吸收峰所對應(yīng)的波長即為蛋白質(zhì)最大吸收波長，結(jié)果見圖1。圖1蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線圖

圖1、牛血清白蛋白在250—300nm波長吸收光譜曲線圖友情復(fù)敘（1）、需要強(qiáng)調(diào)的是：紫外、可見分光光度法測定樣品時都需要用一個“空白管”，它主要是用于儀器?！傲泓c(diǎn)”用?？瞻坠芤话阌至?xí)慣稱“零管”和“對照管”。（2）、能作為“零管”溶液的條件？一般要求是：被測定的溶質(zhì)的溶劑作為零管溶液，但是如果實(shí)驗本身要求不高或所用溶劑與蒸餾水在某一特定的波長吸光度差異很?。ū容^過），也可以直接用蒸餾水甚至自來水代替。（3）、在特征吸收峰附近波長間隔盡量要小，否則會錯過真正的特征吸收峰值。特征吸收峰通常又稱最大吸收峰，如蛋白質(zhì)、核酸分別在280nm和260nm時的吸收值最大。（4）、在吸收光譜曲線及含量的測定中，要達(dá)到結(jié)果的準(zhǔn)確性，除了自身的操作水平外，還要保證分光