生化分析實(shí)驗(yàn)課紫外分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)吸收光譜曲線

紫外分光光度法

測(cè)定蛋白質(zhì)吸收光譜曲線一實(shí)驗(yàn)原理

蛋白質(zhì)所含有的一些芳香族氨基酸（主要是苯丙氨酸，酪氨酸）具有共軛雙鍵結(jié)構(gòu)能夠產(chǎn)生π→π﹡及n→π﹡類型的電子躍遷，因此能夠在近紫外光區(qū)產(chǎn)生光吸收，并且在280nm波長(zhǎng)處有一特征吸收峰。利用這一特性，通過對(duì)蛋白質(zhì)紫外吸收光譜曲線的測(cè)定，可以進(jìn)行定性分析。二實(shí)驗(yàn)?zāi)康呐c要求（1）、了解紫外分光光度儀的基本原理和使用方法。

（2）、學(xué)習(xí)和掌握紫外吸收光譜曲線的制作方法。

（3）、了解和掌握蛋白質(zhì)的定性原理。三實(shí)驗(yàn)主要儀器與器材

3-1、實(shí)驗(yàn)儀器

（1）、紫外分光光度儀

（2）、混合器

（3）、天平3-2、實(shí)驗(yàn)器材（1）、定容瓶（2）、燒杯（3）、滴管（4）、骨勺（5）、稱量紙（6）、剪刀（7）、鑷子（8）、洗瓶（9）、玻棒（10）、記號(hào)筆（11）、標(biāo)簽紙（12）、坐標(biāo)紙四試劑及配制4-1牛血清白蛋白

[試劑純,上海試劑有限責(zé)任公司]

牛血清白蛋白溶液的配制（1.0毫克/毫升）：

稱取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品50毫克，置于50毫升容量瓶中，先加適量蒸餾水將其溶解，然后補(bǔ)加蒸餾水定容至刻度，混勻后即濃度為1.0毫克/毫升的溶液。

五操作步驟與結(jié)果

5-1、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線的測(cè)定

采用2只光徑1.0厘米潔凈的石英比色杯，分別倒入蒸餾水4.0毫升和牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品溶液4.0毫升于各比色杯中，以蒸餾水（或溶劑）為空白溶液，調(diào)儀器零點(diǎn)（具體方法詳見儀器操作說明書）。標(biāo)準(zhǔn)品或測(cè)試樣品溶液在250—300nm波長(zhǎng)的范圍內(nèi)，以每間隔5個(gè)nm波長(zhǎng)依次測(cè)定，同時(shí)記錄各波長(zhǎng)蛋白質(zhì)溶液的吸光值于表1

中（結(jié)果見表1）。在每次更換測(cè)定波長(zhǎng)時(shí)均需要重新調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)后，方能測(cè)定。對(duì)測(cè)定波長(zhǎng)的范圍和間隔大小，可根據(jù)不同樣品的實(shí)際情況和要求加以確定。牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液在不同波長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果

表1-牛血清白蛋白樣品溶液在250—300nm波長(zhǎng)吸光度結(jié)果表波長(zhǎng)（nm）

250.0255.0260.0265.0270.0275.0277.5吸光度(A)

波長(zhǎng)（nm）

280.0282.5285.0290.0295.0300.0305.0吸光度(A)

5-2、蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線的制作

以表1測(cè)定的波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，相對(duì)應(yīng)的吸光度為縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)作圖。然后分別將圖中各點(diǎn)用線連起來，即得到蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線，其中吸收峰所對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)即為蛋白質(zhì)最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果見圖1。圖1蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜曲線圖

圖1、牛血清白蛋白在250—300nm波長(zhǎng)吸收光譜曲線圖友情復(fù)敘（1）、需要強(qiáng)調(diào)的是：紫外、可見分光光度法測(cè)定樣品時(shí)都需要用一個(gè)“空白管”，它主要是用于儀器校“零點(diǎn)”用?？瞻坠芤话阌至?xí)慣稱“零管”和“對(duì)照管”。（2）、能作為“零管”溶液的條件？一般要求是：被測(cè)定的溶質(zhì)的溶劑作為零管溶液，但是如果實(shí)驗(yàn)本身要求不高或所用溶劑與蒸餾水在某一特定的波長(zhǎng)吸光度差異很?。ū容^過），也可以直接用蒸餾水甚至自來水代替。（3）、在特征吸收峰附近波長(zhǎng)間隔盡量要小，否則會(huì)錯(cuò)過真正的特征吸收峰值。特征吸收峰通常又稱最大吸收峰，如蛋白質(zhì)、核酸分別在280nm和260nm時(shí)的吸收值最大。（4）、在吸收光譜曲線及含量的測(cè)定中，要達(dá)到結(jié)果的準(zhǔn)確性，除了自身的操作水平外，還要保證分光