蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進展

PAGE1蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進展摘要：提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性已經(jīng)成為生物學(xué)以及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的研究熱點。蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)是按預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能，通過分子設(shè)計和DNA重組技術(shù)對現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類社會需要的新型蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)工程的研究中，提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是一個重要目標(biāo)。本文具體闡述了蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因、提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的途徑以及目前的一些方法，著重講了蛋白質(zhì)工程技術(shù)中的理性設(shè)計。最后對現(xiàn)階段關(guān)于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進行了總結(jié)。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)工程；蛋白質(zhì)；穩(wěn)定性Abstract:Ithasalreadybeenaresearchhotpotinthebiologyandproteinengineeringtoimprovethestabilityoftheprotein.ThebasicgoalofproteinengineeringistoproduceaproteinwhichisbetterthanthenatureproteinthroughthemoleculardesignandDNArecombinationtechnology,basedontheexpectedstructureandfunction.Thenewproteinismoreinthelinewiththehumansociety’sneeds.Inthispaper,thereasonswhichleadtoprotein’sinstability,thewaystoimprovethestabilityofprotein,andtheprocessintheproteinstabilityresearcharedetailedlypresented.Andtheemphasisisontherationaldesign.Intheend,thepresentresearchinimprovingthestabilityofproteinissummarized.Keywords:proteinengineering;protein;stability前言蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，利用基因工程技術(shù)對現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造，組建成新型蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨特的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，所以只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個或兩個堿基就能通過改變氨基酸達到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)有很多生物學(xué)特性，其多種多樣的生物學(xué)功能與其特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化時，會使其功能活性也隨之改變。對于蛋白質(zhì)而言，其穩(wěn)定性是非常重要的。因此，蛋白質(zhì)工程在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上起到了至關(guān)重要的作用[1]。目前對許多蛋白，如T4溶菌酶和芽孢桿菌RNA酶已有系統(tǒng)研究，揭示了影響穩(wěn)定性的一些重要結(jié)構(gòu)因素。并用于改善重要的工業(yè)用酶的穩(wěn)定性。隨著突變方法、突變體高通量篩選技術(shù)、基因結(jié)構(gòu)與功能研究的突破。特別是PCR技術(shù)的進一步成熟，DNA改組技術(shù)更加成熟．使得DNA改組成為蛋白質(zhì)體外分子進化的主流技術(shù)。DNA改組或家族改組是通過單個基因或多個家族基因產(chǎn)生同源重組的突變庫．并結(jié)合有效的篩選策略獲得具有目標(biāo)性狀的蛋白。DNA改組技術(shù)具有許多重要優(yōu)點。例如不需要事先了解結(jié)構(gòu)信息，也不需要了解蛋白質(zhì)的功能關(guān)系，其缺點是需要配合快速、可靠的鑒別突變體的方法。1影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素1.1疏水相互作用在水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象被稱為疏水相互作用。疏水相互作用并不是疏水基團之間的吸引力，而是疏水基團或疏水側(cè)鏈出于避開水的需要而被迫接近。疏水相互作用主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中最重要的一個因素[2]。1.2氫鍵氫鍵是指氫供體和氫受體的之間距離不超過3A，并且氫供體與氫受體之間的夾角小于90o時形成的非共價鍵。氫供體與氫受體廣泛存在于蛋白質(zhì)的主鏈、側(cè)鏈以及蛋白質(zhì)周圍的水分子中，因此在多肽鏈內(nèi)以及蛋白質(zhì)與周圍的水介質(zhì)之間都可以形成氫鍵。在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成一個氫鍵所獲得平均能量約為0.6kcaL/mol[3]。1.3離子鍵帶有相反電荷的氨基酸殘基之間的靜電力稱為離子鍵或鹽鍵(ionicbond)，離子鍵對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性具有非常重要的作用陽。Das等[4]系統(tǒng)比較了12個物種的基因組(其中4個嗜熱古細菌、1個嗜熱細菌、1個真核生物、6個中溫細菌)，發(fā)現(xiàn)在嗜熱菌中的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的α-螺旋區(qū)含有的三種帶電荷的氨基酸(主要是Glu、Lys和Arg)的數(shù)量要明顯高于中溫菌。這些增加的帶電荷氨基酸可以在螺旋內(nèi)部或是在螺旋之間形成更多的鹽鍵，這對于維系嗜熱蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起到非常關(guān)鍵的作用。1.4芳香環(huán)的相互作用芳香環(huán)相互作用主要包括陽離子和芳香環(huán)(cation-π)之間以及芳香環(huán)與芳香環(huán)之間的相互作用。Cation-π相互作用主要是帶正電荷離子與芳香環(huán)的相互作用，這種相互作用較離子鍵的能量要高兩倍。研究表明，超過70％的精氨酸殘基的側(cè)鏈附近都有芳香族氨基酸的側(cè)鏈存在，而位于蛋白質(zhì)表面的色氨酸有大約30％都與陽離子有相互作用[5]。通過系統(tǒng)比較900個中溫蛋白質(zhì)以及300個嗜熱蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，嗜熱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中cation-π鍵出現(xiàn)的頻率要遠遠高于中溫蛋白質(zhì)[6]，這種相互作用可以提高蛋白質(zhì)對熱的適應(yīng)性。芳香環(huán)與芳香環(huán)之間的相互作用是指兩個芳香類氨基酸(Trp、Tyr以及Phe)苯環(huán)中心的距離不超過7.0A時產(chǎn)生的相互作用，通常這些芳香類氨基酸包埋或部分包埋在蛋白質(zhì)的疏水核心，對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性會產(chǎn)生重要的影響[5]。1.5二硫鍵二硫鍵(disulfidebond)可通過降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值來達到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的，也是影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。利用突變技術(shù)在酶分子中的合適位置引入二硫鍵可以顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。如利用軟件DisulfidebyDesign在來源于Rhizomucormiehei的脂肪酶的第96及106位氨基酸處設(shè)計了一個二硫鍵，使該酶的半衰期延長了2～4.8倍[7]。2提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的基本途徑2.1填充疏水內(nèi)核疏水側(cè)鏈的內(nèi)埋使其屏蔽于溶劑分子．是蛋白質(zhì)折疊的驅(qū)動力和構(gòu)象穩(wěn)定的重要因素。天然蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)核雖然是密集的．但也常常有空隙存在。過去在對Barnase的研究中發(fā)現(xiàn)，通過定位突變技術(shù)在疏水內(nèi)核中引入空隙。使得酶分子的穩(wěn)定性顯著降低。反之。通過減少疏水內(nèi)核的空隙，可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。然而疏水效應(yīng)在影響分子穩(wěn)定性的同時．主鏈張力所產(chǎn)生的能量對穩(wěn)定性也有顯著作用．因此，通過這種途徑穩(wěn)定蛋白質(zhì)需要同時兼顧這兩種作用。實際上，從目前來看．這種方法雖在理論上具有可行性。但是實踐中效果并不顯著。甚至有許多困難[8]。2.2減少非折疊的構(gòu)象通過引進二硫鍵，替換Gly，增加Pro，達到減少非折疊構(gòu)象的目的。蛋白質(zhì)非折疊構(gòu)象的數(shù)量越大，折疊成單一天然態(tài)所消耗的焓越高，因此減少非折疊構(gòu)象的數(shù)量可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。其中最有效的方法是引入二硫鍵。引入的半胱氨酸之間的環(huán)鏈越長，非折疊結(jié)構(gòu)受到的約束就越強，結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定。但是，通過蛋白質(zhì)工程途徑引進二硫鍵時，不能簡單、隨意地選取在空間上相近的2個殘基位置，必須分析它們是否符合形成張力-S-S-鍵的條件。例如在T4溶菌酶中引入二硫鍵，可顯著提高其熱穩(wěn)定性。將Gly突變成其它氨基酸或增加蛋白質(zhì)的數(shù)量，是減少非折疊構(gòu)象以提高穩(wěn)定性的又一條有效途徑。這主要是因為Gly沒有側(cè)鏈。所以具有比其它氨基酸殘基更大的構(gòu)象自由度。脯氨酸的側(cè)鏈共價固定在主鏈上。具有比其它殘基更少的自由度，因而對穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象有非常重要的作用。對于突變位置必須嚴(yán)格選擇．避免引起折疊構(gòu)象中的主鏈構(gòu)象變化或破壞已有的側(cè)鏈相互作用。值得注意的是。這種通過突變引起熵變的效應(yīng)是加和性的，許多這種突變的聯(lián)合效應(yīng)會顯著增加一個蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。2.3蛋白質(zhì)表面和表面靜電相互作用有學(xué)者研究表明。蛋白質(zhì)的表面和表面靜電對于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要的影響。靜電相互作用的大網(wǎng)絡(luò)存在以及較高的低聚體的存在被推測是有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這是因為在許多嗜極端條件的酶上發(fā)現(xiàn)了這個現(xiàn)象。2.4穩(wěn)定α螺旋α螺旋作為一個偶極子在N端帶正電荷，而在C端帶負電荷，通過殘基替換來穩(wěn)定α螺旋偶極子，是提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的又一條有效途徑。3蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)在生物催化過程中執(zhí)行許多新功能性質(zhì)的先決條件。許多蛋白質(zhì)工程方法被應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的設(shè)計中。目前提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法主要有理性設(shè)計和組合設(shè)計。3.1理性設(shè)計提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性所謂蛋白質(zhì)理性設(shè)計是基于對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認識，通過定點飽和突變技術(shù)改造蛋白質(zhì)的一種方法。進行蛋白質(zhì)的理性設(shè)計意味著在突變之前，人們需要進行仔細的考慮與推測，選擇特定位點進行突變。該個方法通常要求有蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，并且要求對蛋白質(zhì)的催化機理、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及酶的熱穩(wěn)定性機制有深入的了解。由于人的理性參與，可以在較短的時間內(nèi)設(shè)計并得到性質(zhì)改善的突變體。理性設(shè)計獲得的結(jié)果可以反過來擴充人們對于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認識。但是由于目前人們對酶的催化機制以及酶熱穩(wěn)定性機制的認識有限，理性設(shè)計的應(yīng)用范圍受到很大的限制。到現(xiàn)在為止應(yīng)用比較成功的方法主要有以下幾種：3.1.1蛋白質(zhì)表面電荷的優(yōu)化策略蛋白質(zhì)通常是在內(nèi)部形成一個疏水核心，而在其表面分布著一些帶電荷的氨基酸，這些分布在蛋白質(zhì)表面的帶電荷氨基酸之間可以通過電荷之間的相互作用，給蛋白質(zhì)形成一個保護網(wǎng)，增加蛋白質(zhì)對高溫的抗性。因此通?？梢酝ㄟ^對蛋白質(zhì)表面帶電荷的氨基酸進行重新設(shè)計優(yōu)化，使其表面的電荷分布更加合理，從而提高其熱穩(wěn)定性。3.1.2同源比對的策略研究發(fā)現(xiàn)，在嗜熱蛋白質(zhì)與其同源的中溫蛋白質(zhì)之間往往具有較高的相似性(通?？蛇_到40％～80％)[9]，因此，可以通過比較熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)與熱穩(wěn)定差的蛋白質(zhì)的序列，找出與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸位點，然后對其進行突變，進而可以提高中溫蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。3.1.3基于二硫鍵的設(shè)計策略在蛋白質(zhì)特定位置上的二硫鍵可以對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用。它主要通過降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值來達到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。3.1.4溫度因子的策略溫度因子(B-factor)的概念起源于晶體研究，主要是用來體現(xiàn)晶體中原子構(gòu)象狀態(tài)的一種“模糊度”(diffusion)。這個“模糊度”實際上反映了蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)。B-factor越高，“模糊度”越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強。在晶體學(xué)數(shù)據(jù)中，B-factor一般是以原子為單位給出的，通常我們將其換算成相應(yīng)氨基酸殘基的B-factor，從而可以分析氨基酸殘基的構(gòu)象穩(wěn)定性或其柔性。研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中B-factor值較高的氨基酸突變后，部分突變體的熱穩(wěn)定性可以得到明顯的提高。因此有些研究也利用機器學(xué)習(xí)算法來預(yù)測B-factor，從而輔助突變位點的設(shè)計。3.1.5脯氨酸效應(yīng)的設(shè)計策略脯氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中非常特殊的一個，它包含一個亞氨基、一個羧基及一個吡咯烷環(huán)側(cè)鏈。由于其N原子位于吡咯烷環(huán)上，使得Cα-N單鍵不能旋轉(zhuǎn)，因而不可能形成僅α-螺旋所需的ψ角，加上脯氨酸沒有N-H基，其側(cè)鏈又阻止自身C=0基接近主鏈骨架的N-H基，不能生成維持α-螺旋構(gòu)象所需的氫鍵，因此脯氨酸是α-螺旋的最大破壞者。在多肽鏈中，脯氨酸不僅限制自身的(ψ，Ψ)值，也限制前一個氨基酸的(ψ，Ψ)值。脯氨酸的N-Cα旋轉(zhuǎn)受到吡咯烷環(huán)的束縛，因而具有更小的構(gòu)象自由度，且限定其前面氨基酸只有有限的構(gòu)象空間，這說明脯氨酸的引入可以降低蛋白質(zhì)去折疊時的骨架熵，即增加蛋白質(zhì)的剛性。與脯氨酸相對應(yīng)的氨基酸為甘氨酸，由于該氨基酸沒有側(cè)鏈，具有靈活構(gòu)象，它的(ψ，Ψ)值有較大的選擇范圍，可增加蛋白質(zhì)的柔性。因此有研究表明，在蛋白質(zhì)構(gòu)象不穩(wěn)定的區(qū)段如β-轉(zhuǎn)角或無規(guī)卷曲中引入脯氨酸，可以提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。3.1.6基于蛋白質(zhì)解析折疊自由能的設(shè)計策略蛋白質(zhì)解折疊自由能(ΔGu)是蛋白質(zhì)熱動力學(xué)參數(shù)中最重要的參數(shù)，也是反應(yīng)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個通用指標(biāo)，因此許多關(guān)于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究都是利用生物信息學(xué)的方法來模擬突變對蛋白質(zhì)解折疊自由能(ΔGu)的影響，即ΔΔGu.當(dāng)ΔΔGu的值大于零時，表明該突變對蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有正效應(yīng)，反之有負效應(yīng)。其中ΔΔGu的數(shù)據(jù)主要是來自于ProTherm數(shù)據(jù)庫.3.2組合設(shè)計提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性組合設(shè)計是通過一種策略使得在基因水平上產(chǎn)生差異化，同時需要大量的高通量篩選來鑒別設(shè)計是否成功。其目標(biāo)是在于通過在蛋白質(zhì)隨機微點引入隨機突變來提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。組合設(shè)計相較于理性設(shè)計的優(yōu)點在于不需要詳細的蛋白質(zhì)殘基信息和知識，但是，從大量的組合產(chǎn)生的變異體集合中，有效鑒別穩(wěn)定性提升的蛋白質(zhì)是極為重要的，因為鑒別篩選工作非常的重要。組合設(shè)計方法又稱為分子進化，是一種非理性設(shè)計方法。其需要配以高通量篩選技術(shù)和選擇方法定向選擇出穩(wěn)定性提高的蛋白質(zhì)，從而體現(xiàn)該方法的有適合特點。利用組合設(shè)計方法，配以熒光檢測儀、圓二色譜分析、DSC等檢測儀器，獲得精確的蛋白質(zhì)去折疊曲線，從而考察蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過應(yīng)用選擇方法，組合容錯PCR技術(shù)和DNA改組技術(shù)，Hecky等[10]將β-內(nèi)酰胺酶的最適溫度從35℃提高到65℃。有文獻報道，用該方法對酯酶進行定向進化，經(jīng)6個循環(huán)突變，Tm值增加14℃以上。4蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究進展4.1環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性的研究環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是由芽孢類細菌產(chǎn)生的一類酶，主要出現(xiàn)在桿狀細菌中。是一種重要的環(huán)糊精生產(chǎn)工業(yè)用酶，該轉(zhuǎn)移酶能進行環(huán)化、偶合、歧化、水解4種反應(yīng)。環(huán)糊精廣泛的用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和化學(xué)工業(yè)等生產(chǎn)領(lǐng)域，為了提高環(huán)糊精的產(chǎn)量，需要環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有更高的熱穩(wěn)定性。傅毅等[11]首先使用分子動力學(xué)模擬研究環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性，以補充實驗上不易獲得的原子能級和時間相關(guān)的信息。使用同源建模方法構(gòu)建環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的三維結(jié)構(gòu)，研究氨基酸的突變對環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶耐熱性的影響，用CHARMM能量計算環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的能量與酶蛋白熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系。實驗結(jié)果證明基酸殘基經(jīng)過突變，突變型比野生型含帶電殘基更多。相應(yīng)的，在蛋白天然結(jié)構(gòu)中突變型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶中，鹽橋數(shù)量增加了10％。這些電荷之間、非極性殘基之間的非共價鍵作用力的增強，提高了突變體的剛性，降低了突變體蛋白質(zhì)分子的總能量，最后增加突變體蛋白質(zhì)的耐熱性。此外，傅毅等[12]在2012年采用分子動力學(xué)模擬取樣研究了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的N-端環(huán)狀區(qū)域中氫鍵與鹽橋?qū)ζ淠蜔嵝缘挠绊懽饔?，得到的結(jié)果說明在蛋白質(zhì)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶中合適的位置增加帶電氨基酸數(shù)量，增強電荷間靜電相互作用，對于提高環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性是有效的。4.2內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)環(huán)化提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)主鏈骨架環(huán)化是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)的新方法。在內(nèi)含肽的作用下，蛋白質(zhì)的N端和C端生成一個天然的肽鍵，達到蛋白質(zhì)環(huán)化的目的。環(huán)化可以減小蛋白質(zhì)構(gòu)象的熵值，從而使蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。1999年Scott等[13]使用DnaE內(nèi)含肽在體內(nèi)環(huán)化了大腸桿菌的二氫葉酸還原酶和有8個氨基酸的酪氨酶抑制子川狼毒素F。環(huán)化了的二氫葉酸還原酶在體外展現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定性和對蛋白酶的抗性；川狼毒素F則在體內(nèi)實現(xiàn)了環(huán)化，并且它可以抑制重組的酪氨酶。同年，Andreas等成功地在體外環(huán)化了β內(nèi)酰胺酶，骨架的環(huán)化提高了此酶的穩(wěn)定性。4.3W544F定點突變提高蘇云金桿菌CrylAc蛋白的穩(wěn)定性的研究W544是CrylAc蛋白上獨特于其它Cry類蛋白的一個氨基酸，它與F578和F604一起組成一個“螺旋槳狀”的疏水簇，通過疏水相互作用維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。王發(fā)祥等[14]通過定點突變將W544保守地替換為苯丙氨酸，SDS—PAGE分析結(jié)果表明其純化的原毒素對紫外照射、胰蛋白酶處理和室溫存貯的穩(wěn)定性相對于野生CrylAe都有一定程度的提高；經(jīng)原子力顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)W544F產(chǎn)生的晶體兩個頂點間的垂直距離比野生型CrylAc約長0.6μm，且晶體表面不及野生型光滑；此外，W544F與野生CrylAc的殺蟲活性相似，但經(jīng)過紫外光照射9h后，其保留的殺蟲活性比野生型高4倍以上。W544F突變較好地解決了CrylAe毒素蛋白在田間應(yīng)用的不穩(wěn)定性問題。4.4定點突變技術(shù)提高植酸酶的穩(wěn)定性有學(xué)者對E.colipH12.5酸性磷酸酶進行定點突變，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽鏈中的幾個氨基酸殘基，增加酶分子潛在的糖基化位點的數(shù)目。突變體基因在P.pastoris中表達，得到了糖基化程度、酶活性及熱穩(wěn)定性改變很大的突變體植酸酶。近年來的研究也表明，單一氨基酸的替換可以改變酶蛋白的熱穩(wěn)定性，尤其是蛋白質(zhì)殘基對改善熱穩(wěn)定性的作用尤為顯著。5結(jié)語影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素非常復(fù)雜，通過研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，特別是三維結(jié)構(gòu)對于穩(wěn)定性的關(guān)系，采用蛋白質(zhì)工程對天然蛋白質(zhì)進行突變改造，以期獲得目標(biāo)穩(wěn)定性。通過蛋白質(zhì)設(shè)計方法對突變體進行篩選，獲得高表達的突變體，生產(chǎn)適合工業(yè)化應(yīng)用的高穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。目前，相關(guān)的研究正在進行中。然而，盡管文章中所提到的一些蛋白質(zhì)工程技術(shù)方法在提高一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上得到了成功的應(yīng)用，但是由于影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素多且復(fù)雜，加之現(xiàn)階段蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的相關(guān)數(shù)據(jù)很少，且蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和其活性的最適溫度之間的關(guān)系又是一個大問題。因此，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究仍然是現(xiàn)代計算生物學(xué)家及蛋白質(zhì)工程學(xué)家努力的方向。參考文獻[1]汪世華.蛋白質(zhì)工程[M].北京：科學(xué)出版社，2008.[2]BeheraRK，MazumdarS.ThermodynamicbasisofthethermostabilityofCYPl75A1fromThermusthermophilus[J].Int..J.Bio1.Macromo1.,2010,46(4).[3]陳路清,張秀艷,唐彥捷等.嗜熱酶的穩(wěn)定機制和穩(wěn)定策略的研究進展[J].科技通報,2008,6.[4]DosR，GemteinM．Thestabilityofthermophilicproteins：astudybasedoncomprehensivegenomecomparison[J]．Funct．Integr．Genomics，2000，l(1).[5]KorkegianA，BlackME，BakerD，eta1．．Computationalthermostabilizationofallenzyme[J]．Science，2005，308(5723).[6]ChakravartyS，VaradarajanR．Elucidationoffactobresponsibleforenhancedthermalstabilityofproteins：astructuralgenomicsbasedstudy[J]．Biochemistry(Mosc)．，2002，41(25).[7]HanZL，HanSY，ZhengSP，etu1．．EnhancingthermostabilityofaRhizomucormieheilipasebyengineeringadisulfidebondanddisplayingontheyeastcellsurface[J].Appl．Microbi01．Biotechn01．，2009，85(1).[8]王大成．蛋白質(zhì)工程[M]．北京：科學(xué)出版社，2001．[9]AckermanSH．GattiDL，ThecontributionofcocvolvingresiduestothestabilityofKDO8Psynt