蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進(jìn)展

PAGE1蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進(jìn)展摘要：提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性已經(jīng)成為生物學(xué)以及蛋白質(zhì)工程領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)工程的基本目標(biāo)是按預(yù)期的結(jié)構(gòu)和功能，通過(guò)分子設(shè)計(jì)和DNA重組技術(shù)對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)加以定向改造、設(shè)計(jì)、構(gòu)建并最終生產(chǎn)出性能比天然蛋白質(zhì)更加優(yōu)良、更加符合人類(lèi)社會(huì)需要的新型蛋白質(zhì)。在蛋白質(zhì)工程的研究中，提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性是一個(gè)重要目標(biāo)。本文具體闡述了蛋白質(zhì)不穩(wěn)定的原因、提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的途徑以及目前的一些方法，著重講了蛋白質(zhì)工程技術(shù)中的理性設(shè)計(jì)。最后對(duì)現(xiàn)階段關(guān)于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究進(jìn)行了總結(jié)。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)工程；蛋白質(zhì)；穩(wěn)定性Abstract:Ithasalreadybeenaresearchhotpotinthebiologyandproteinengineeringtoimprovethestabilityoftheprotein.ThebasicgoalofproteinengineeringistoproduceaproteinwhichisbetterthanthenatureproteinthroughthemoleculardesignandDNArecombinationtechnology,basedontheexpectedstructureandfunction.Thenewproteinismoreinthelinewiththehumansociety’sneeds.Inthispaper,thereasonswhichleadtoprotein’sinstability,thewaystoimprovethestabilityofprotein,andtheprocessintheproteinstabilityresearcharedetailedlypresented.Andtheemphasisisontherationaldesign.Intheend,thepresentresearchinimprovingthestabilityofproteinissummarized.Keywords:proteinengineering;protein;stability前言蛋白質(zhì)工程是以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系研究為基礎(chǔ)，利用基因工程技術(shù)對(duì)現(xiàn)存蛋白質(zhì)加以改造，組建成新型蛋白質(zhì)的現(xiàn)代生物技術(shù)。蛋白質(zhì)是由許多氨基酸按一定順序連接而成的，每一種蛋白質(zhì)有自己獨(dú)特的氨基酸順序，所以改變其中關(guān)鍵的氨基酸就能改變蛋白質(zhì)的性質(zhì)。而氨基酸是由三聯(lián)體密碼決定的，所以只要改變構(gòu)成遺傳密碼的一個(gè)或兩個(gè)堿基就能通過(guò)改變氨基酸達(dá)到改造蛋白質(zhì)的目的。蛋白質(zhì)有很多生物學(xué)特性，其多種多樣的生物學(xué)功能與其特定的空間構(gòu)象密切相關(guān)，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，會(huì)使其功能活性也隨之改變。對(duì)于蛋白質(zhì)而言，其穩(wěn)定性是非常重要的。因此，蛋白質(zhì)工程在維持蛋白質(zhì)穩(wěn)定性上起到了至關(guān)重要的作用[1]。目前對(duì)許多蛋白，如T4溶菌酶和芽孢桿菌RNA酶已有系統(tǒng)研究，揭示了影響穩(wěn)定性的一些重要結(jié)構(gòu)因素。并用于改善重要的工業(yè)用酶的穩(wěn)定性。隨著突變方法、突變體高通量篩選技術(shù)、基因結(jié)構(gòu)與功能研究的突破。特別是PCR技術(shù)的進(jìn)一步成熟，DNA改組技術(shù)更加成熟．使得DNA改組成為蛋白質(zhì)體外分子進(jìn)化的主流技術(shù)。DNA改組或家族改組是通過(guò)單個(gè)基因或多個(gè)家族基因產(chǎn)生同源重組的突變庫(kù)．并結(jié)合有效的篩選策略獲得具有目標(biāo)性狀的蛋白。DNA改組技術(shù)具有許多重要優(yōu)點(diǎn)。例如不需要事先了解結(jié)構(gòu)信息，也不需要了解蛋白質(zhì)的功能關(guān)系，其缺點(diǎn)是需要配合快速、可靠的鑒別突變體的方法。1影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素1.1疏水相互作用在水介質(zhì)中球狀蛋白質(zhì)的折疊總是傾向于把疏水殘基埋藏在分子的內(nèi)部，這一現(xiàn)象被稱(chēng)為疏水相互作用。疏水相互作用并不是疏水基團(tuán)之間的吸引力，而是疏水基團(tuán)或疏水側(cè)鏈出于避開(kāi)水的需要而被迫接近。疏水相互作用主要影響蛋白質(zhì)的構(gòu)象熵，是蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定中最重要的一個(gè)因素[2]。1.2氫鍵氫鍵是指氫供體和氫受體的之間距離不超過(guò)3A，并且氫供體與氫受體之間的夾角小于90o時(shí)形成的非共價(jià)鍵。氫供體與氫受體廣泛存在于蛋白質(zhì)的主鏈、側(cè)鏈以及蛋白質(zhì)周?chē)乃肿又?，因此在多肽鏈?nèi)以及蛋白質(zhì)與周?chē)乃橘|(zhì)之間都可以形成氫鍵。在蛋白質(zhì)內(nèi)部形成一個(gè)氫鍵所獲得平均能量約為0.6kcaL/mol[3]。1.3離子鍵帶有相反電荷的氨基酸殘基之間的靜電力稱(chēng)為離子鍵或鹽鍵(ionicbond)，離子鍵對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性具有非常重要的作用陽(yáng)。Das等[4]系統(tǒng)比較了12個(gè)物種的基因組(其中4個(gè)嗜熱古細(xì)菌、1個(gè)嗜熱細(xì)菌、1個(gè)真核生物、6個(gè)中溫細(xì)菌)，發(fā)現(xiàn)在嗜熱菌中的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)的α-螺旋區(qū)含有的三種帶電荷的氨基酸(主要是Glu、Lys和Arg)的數(shù)量要明顯高于中溫菌。這些增加的帶電荷氨基酸可以在螺旋內(nèi)部或是在螺旋之間形成更多的鹽鍵，這對(duì)于維系嗜熱蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性起到非常關(guān)鍵的作用。1.4芳香環(huán)的相互作用芳香環(huán)相互作用主要包括陽(yáng)離子和芳香環(huán)(cation-π)之間以及芳香環(huán)與芳香環(huán)之間的相互作用。Cation-π相互作用主要是帶正電荷離子與芳香環(huán)的相互作用，這種相互作用較離子鍵的能量要高兩倍。研究表明，超過(guò)70％的精氨酸殘基的側(cè)鏈附近都有芳香族氨基酸的側(cè)鏈存在，而位于蛋白質(zhì)表面的色氨酸有大約30％都與陽(yáng)離子有相互作用[5]。通過(guò)系統(tǒng)比較900個(gè)中溫蛋白質(zhì)以及300個(gè)嗜熱蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，嗜熱蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中cation-π鍵出現(xiàn)的頻率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于中溫蛋白質(zhì)[6]，這種相互作用可以提高蛋白質(zhì)對(duì)熱的適應(yīng)性。芳香環(huán)與芳香環(huán)之間的相互作用是指兩個(gè)芳香類(lèi)氨基酸(Trp、Tyr以及Phe)苯環(huán)中心的距離不超過(guò)7.0A時(shí)產(chǎn)生的相互作用，通常這些芳香類(lèi)氨基酸包埋或部分包埋在蛋白質(zhì)的疏水核心，對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性會(huì)產(chǎn)生重要的影響[5]。1.5二硫鍵二硫鍵(disulfidebond)可通過(guò)降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值來(lái)達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的，也是影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的關(guān)鍵因素。利用突變技術(shù)在酶分子中的合適位置引入二硫鍵可以顯著提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。如利用軟件DisulfidebyDesign在來(lái)源于Rhizomucormiehei的脂肪酶的第96及106位氨基酸處設(shè)計(jì)了一個(gè)二硫鍵，使該酶的半衰期延長(zhǎng)了2～4.8倍[7]。2提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的基本途徑2.1填充疏水內(nèi)核疏水側(cè)鏈的內(nèi)埋使其屏蔽于溶劑分子．是蛋白質(zhì)折疊的驅(qū)動(dòng)力和構(gòu)象穩(wěn)定的重要因素。天然蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)核雖然是密集的．但也常常有空隙存在。過(guò)去在對(duì)Barnase的研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)定位突變技術(shù)在疏水內(nèi)核中引入空隙。使得酶分子的穩(wěn)定性顯著降低。反之。通過(guò)減少疏水內(nèi)核的空隙，可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。然而疏水效應(yīng)在影響分子穩(wěn)定性的同時(shí)．主鏈張力所產(chǎn)生的能量對(duì)穩(wěn)定性也有顯著作用．因此，通過(guò)這種途徑穩(wěn)定蛋白質(zhì)需要同時(shí)兼顧這兩種作用。實(shí)際上，從目前來(lái)看．這種方法雖在理論上具有可行性。但是實(shí)踐中效果并不顯著。甚至有許多困難[8]。2.2減少非折疊的構(gòu)象通過(guò)引進(jìn)二硫鍵，替換Gly，增加Pro，達(dá)到減少非折疊構(gòu)象的目的。蛋白質(zhì)非折疊構(gòu)象的數(shù)量越大，折疊成單一天然態(tài)所消耗的焓越高，因此減少非折疊構(gòu)象的數(shù)量可以提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。其中最有效的方法是引入二硫鍵。引入的半胱氨酸之間的環(huán)鏈越長(zhǎng)，非折疊結(jié)構(gòu)受到的約束就越強(qiáng)，結(jié)構(gòu)也越穩(wěn)定。但是，通過(guò)蛋白質(zhì)工程途徑引進(jìn)二硫鍵時(shí)，不能簡(jiǎn)單、隨意地選取在空間上相近的2個(gè)殘基位置，必須分析它們是否符合形成張力-S-S-鍵的條件。例如在T4溶菌酶中引入二硫鍵，可顯著提高其熱穩(wěn)定性。將Gly突變成其它氨基酸或增加蛋白質(zhì)的數(shù)量，是減少非折疊構(gòu)象以提高穩(wěn)定性的又一條有效途徑。這主要是因?yàn)镚ly沒(méi)有側(cè)鏈。所以具有比其它氨基酸殘基更大的構(gòu)象自由度。脯氨酸的側(cè)鏈共價(jià)固定在主鏈上。具有比其它殘基更少的自由度，因而對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象有非常重要的作用。對(duì)于突變位置必須嚴(yán)格選擇．避免引起折疊構(gòu)象中的主鏈構(gòu)象變化或破壞已有的側(cè)鏈相互作用。值得注意的是。這種通過(guò)突變引起熵變的效應(yīng)是加和性的，許多這種突變的聯(lián)合效應(yīng)會(huì)顯著增加一個(gè)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。2.3蛋白質(zhì)表面和表面靜電相互作用有學(xué)者研究表明。蛋白質(zhì)的表面和表面靜電對(duì)于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性具有重要的影響。靜電相互作用的大網(wǎng)絡(luò)存在以及較高的低聚體的存在被推測(cè)是有利于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，這是因?yàn)樵谠S多嗜極端條件的酶上發(fā)現(xiàn)了這個(gè)現(xiàn)象。2.4穩(wěn)定α螺旋α螺旋作為一個(gè)偶極子在N端帶正電荷，而在C端帶負(fù)電荷，通過(guò)殘基替換來(lái)穩(wěn)定α螺旋偶極子，是提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的又一條有效途徑。3蛋白質(zhì)工程提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)在生物催化過(guò)程中執(zhí)行許多新功能性質(zhì)的先決條件。許多蛋白質(zhì)工程方法被應(yīng)用于提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的設(shè)計(jì)中。目前提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的方法主要有理性設(shè)計(jì)和組合設(shè)計(jì)。3.1理性設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性所謂蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)是基于對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系的認(rèn)識(shí)，通過(guò)定點(diǎn)飽和突變技術(shù)改造蛋白質(zhì)的一種方法。進(jìn)行蛋白質(zhì)的理性設(shè)計(jì)意味著在突變之前，人們需要進(jìn)行仔細(xì)的考慮與推測(cè)，選擇特定位點(diǎn)進(jìn)行突變。該個(gè)方法通常要求有蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，并且要求對(duì)蛋白質(zhì)的催化機(jī)理、結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及酶的熱穩(wěn)定性機(jī)制有深入的了解。由于人的理性參與，可以在較短的時(shí)間內(nèi)設(shè)計(jì)并得到性質(zhì)改善的突變體。理性設(shè)計(jì)獲得的結(jié)果可以反過(guò)來(lái)擴(kuò)充人們對(duì)于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的認(rèn)識(shí)。但是由于目前人們對(duì)酶的催化機(jī)制以及酶熱穩(wěn)定性機(jī)制的認(rèn)識(shí)有限，理性設(shè)計(jì)的應(yīng)用范圍受到很大的限制。到現(xiàn)在為止應(yīng)用比較成功的方法主要有以下幾種：3.1.1蛋白質(zhì)表面電荷的優(yōu)化策略蛋白質(zhì)通常是在內(nèi)部形成一個(gè)疏水核心，而在其表面分布著一些帶電荷的氨基酸，這些分布在蛋白質(zhì)表面的帶電荷氨基酸之間可以通過(guò)電荷之間的相互作用，給蛋白質(zhì)形成一個(gè)保護(hù)網(wǎng)，增加蛋白質(zhì)對(duì)高溫的抗性。因此通?？梢酝ㄟ^(guò)對(duì)蛋白質(zhì)表面帶電荷的氨基酸進(jìn)行重新設(shè)計(jì)優(yōu)化，使其表面的電荷分布更加合理，從而提高其熱穩(wěn)定性。3.1.2同源比對(duì)的策略研究發(fā)現(xiàn)，在嗜熱蛋白質(zhì)與其同源的中溫蛋白質(zhì)之間往往具有較高的相似性(通?？蛇_(dá)到40％～80％)[9]，因此，可以通過(guò)比較熱穩(wěn)定性高的蛋白質(zhì)與熱穩(wěn)定差的蛋白質(zhì)的序列，找出與熱穩(wěn)定性相關(guān)的氨基酸位點(diǎn)，然后對(duì)其進(jìn)行突變，進(jìn)而可以提高中溫蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。3.1.3基于二硫鍵的設(shè)計(jì)策略在蛋白質(zhì)特定位置上的二硫鍵可以對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性起到至關(guān)重要的作用。它主要通過(guò)降低蛋白質(zhì)解折疊狀態(tài)的熵值來(lái)達(dá)到穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的目的。3.1.4溫度因子的策略溫度因子(B-factor)的概念起源于晶體研究，主要是用來(lái)體現(xiàn)晶體中原子構(gòu)象狀態(tài)的一種“模糊度”(diffusion)。這個(gè)“模糊度”實(shí)際上反映了蛋白質(zhì)分子在晶體中的構(gòu)象狀態(tài)。B-factor越高，“模糊度”越大，相應(yīng)部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定或柔性越強(qiáng)。在晶體學(xué)數(shù)據(jù)中，B-factor一般是以原子為單位給出的，通常我們將其換算成相應(yīng)氨基酸殘基的B-factor，從而可以分析氨基酸殘基的構(gòu)象穩(wěn)定性或其柔性。研究發(fā)現(xiàn)，將蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中B-factor值較高的氨基酸突變后，部分突變體的熱穩(wěn)定性可以得到明顯的提高。因此有些研究也利用機(jī)器學(xué)習(xí)算法來(lái)預(yù)測(cè)B-factor，從而輔助突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)。3.1.5脯氨酸效應(yīng)的設(shè)計(jì)策略脯氨酸是組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中非常特殊的一個(gè)，它包含一個(gè)亞氨基、一個(gè)羧基及一個(gè)吡咯烷環(huán)側(cè)鏈。由于其N(xiāo)原子位于吡咯烷環(huán)上，使得Cα-N單鍵不能旋轉(zhuǎn)，因而不可能形成僅α-螺旋所需的ψ角，加上脯氨酸沒(méi)有N-H基，其側(cè)鏈又阻止自身C=0基接近主鏈骨架的N-H基，不能生成維持α-螺旋構(gòu)象所需的氫鍵，因此脯氨酸是α-螺旋的最大破壞者。在多肽鏈中，脯氨酸不僅限制自身的(ψ，Ψ)值，也限制前一個(gè)氨基酸的(ψ，Ψ)值。脯氨酸的N-Cα旋轉(zhuǎn)受到吡咯烷環(huán)的束縛，因而具有更小的構(gòu)象自由度，且限定其前面氨基酸只有有限的構(gòu)象空間，這說(shuō)明脯氨酸的引入可以降低蛋白質(zhì)去折疊時(shí)的骨架熵，即增加蛋白質(zhì)的剛性。與脯氨酸相對(duì)應(yīng)的氨基酸為甘氨酸，由于該氨基酸沒(méi)有側(cè)鏈，具有靈活構(gòu)象，它的(ψ，Ψ)值有較大的選擇范圍，可增加蛋白質(zhì)的柔性。因此有研究表明，在蛋白質(zhì)構(gòu)象不穩(wěn)定的區(qū)段如β-轉(zhuǎn)角或無(wú)規(guī)卷曲中引入脯氨酸，可以提高蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性。3.1.6基于蛋白質(zhì)解析折疊自由能的設(shè)計(jì)策略蛋白質(zhì)解折疊自由能(ΔGu)是蛋白質(zhì)熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)中最重要的參數(shù)，也是反應(yīng)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的一個(gè)通用指標(biāo)，因此許多關(guān)于蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的研究都是利用生物信息學(xué)的方法來(lái)模擬突變對(duì)蛋白質(zhì)解折疊自由能(ΔGu)的影響，即ΔΔGu.當(dāng)ΔΔGu的值大于零時(shí)，表明該突變對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性有正效應(yīng)，反之有負(fù)效應(yīng)。其中ΔΔGu的數(shù)據(jù)主要是來(lái)自于ProTherm數(shù)據(jù)庫(kù).3.2組合設(shè)計(jì)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性組合設(shè)計(jì)是通過(guò)一種策略使得在基因水平上產(chǎn)生差異化，同時(shí)需要大量的高通量篩選來(lái)鑒別設(shè)計(jì)是否成功。其目標(biāo)是在于通過(guò)在蛋白質(zhì)隨機(jī)微點(diǎn)引入隨機(jī)突變來(lái)提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。組合設(shè)計(jì)相較于理性設(shè)計(jì)的優(yōu)點(diǎn)在于不需要詳細(xì)的蛋白質(zhì)殘基信息和知識(shí)，但是，從大量的組合產(chǎn)生的變異體集合中，有效鑒別穩(wěn)定性提升的蛋白質(zhì)是極為重要的，因?yàn)殍b別篩選工作非常的重要。組合設(shè)計(jì)方法又稱(chēng)為分子進(jìn)化，是一種非理性設(shè)計(jì)方法。其需要配以高通量篩選技術(shù)和選擇方法定向選擇出穩(wěn)定性提高的蛋白質(zhì)，從而體現(xiàn)該方法的有適合特點(diǎn)。利用組合設(shè)計(jì)方法，配以熒光檢測(cè)儀、圓二色譜分析、DSC等檢測(cè)儀器，獲得精確的蛋白質(zhì)去折疊曲線(xiàn)，從而考察蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。通過(guò)應(yīng)用選擇方法，組合容錯(cuò)PCR技術(shù)和DNA改組技術(shù)，Hecky等[10]將β-內(nèi)酰胺酶的最適溫度從35℃提高到65℃。有文獻(xiàn)報(bào)道，用該方法對(duì)酯酶進(jìn)行定向進(jìn)化，經(jīng)6個(gè)循環(huán)突變，Tm值增加14℃以上。4蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性研究進(jìn)展4.1環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶熱穩(wěn)定性的研究環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶是由芽孢類(lèi)細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)酶，主要出現(xiàn)在桿狀細(xì)菌中。是一種重要的環(huán)糊精生產(chǎn)工業(yè)用酶，該轉(zhuǎn)移酶能進(jìn)行環(huán)化、偶合、歧化、水解4種反應(yīng)。環(huán)糊精廣泛的用于食品、醫(yī)藥、化妝品、農(nóng)業(yè)和化學(xué)工業(yè)等生產(chǎn)領(lǐng)域，為了提高環(huán)糊精的產(chǎn)量，需要環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶具有更高的熱穩(wěn)定性。傅毅等[11]首先使用分子動(dòng)力學(xué)模擬研究環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性，以補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)上不易獲得的原子能級(jí)和時(shí)間相關(guān)的信息。使用同源建模方法構(gòu)建環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的三維結(jié)構(gòu)，研究氨基酸的突變對(duì)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶耐熱性的影響，用CHARMM能量計(jì)算環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶及其突變體的能量與酶蛋白熱穩(wěn)定性之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明基酸殘基經(jīng)過(guò)突變，突變型比野生型含帶電殘基更多。相應(yīng)的，在蛋白天然結(jié)構(gòu)中突變型環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶中，鹽橋數(shù)量增加了10％。這些電荷之間、非極性殘基之間的非共價(jià)鍵作用力的增強(qiáng)，提高了突變體的剛性，降低了突變體蛋白質(zhì)分子的總能量，最后增加突變體蛋白質(zhì)的耐熱性。此外，傅毅等[12]在2012年采用分子動(dòng)力學(xué)模擬取樣研究了環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的N-端環(huán)狀區(qū)域中氫鍵與鹽橋?qū)ζ淠蜔嵝缘挠绊懽饔茫玫降慕Y(jié)果說(shuō)明在蛋白質(zhì)環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶中合適的位置增加帶電氨基酸數(shù)量，增強(qiáng)電荷間靜電相互作用，對(duì)于提高環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶的熱穩(wěn)定性是有效的。4.2內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)環(huán)化提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究?jī)?nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白質(zhì)主鏈骨架環(huán)化是一種穩(wěn)定蛋白質(zhì)的新方法。在內(nèi)含肽的作用下，蛋白質(zhì)的N端和C端生成一個(gè)天然的肽鍵，達(dá)到蛋白質(zhì)環(huán)化的目的。環(huán)化可以減小蛋白質(zhì)構(gòu)象的熵值，從而使蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。1999年Scott等[13]使用DnaE內(nèi)含肽在體內(nèi)環(huán)化了大腸桿菌的二氫葉酸還原酶和有8個(gè)氨基酸的酪氨酶抑制子川狼毒素F。環(huán)化了的二氫葉酸還原酶在體外展現(xiàn)出了更高的熱穩(wěn)定性和對(duì)蛋白酶的抗性；川狼毒素F則在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)了環(huán)化，并且它可以抑制重組的酪氨酶。同年，Andreas等成功地在體外環(huán)化了β內(nèi)酰胺酶，骨架的環(huán)化提高了此酶的穩(wěn)定性。4.3W544F定點(diǎn)突變提高蘇云金桿菌CrylAc蛋白的穩(wěn)定性的研究W544是CrylAc蛋白上獨(dú)特于其它Cry類(lèi)蛋白的一個(gè)氨基酸，它與F578和F604一起組成一個(gè)“螺旋槳狀”的疏水簇，通過(guò)疏水相互作用維持蛋白的三維結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。王發(fā)祥等[14]通過(guò)定點(diǎn)突變將W544保守地替換為苯丙氨酸，SDS—PAGE分析結(jié)果表明其純化的原毒素對(duì)紫外照射、胰蛋白酶處理和室溫存貯的穩(wěn)定性相對(duì)于野生CrylAe都有一定程度的提高；經(jīng)原子力顯微鏡觀(guān)察，發(fā)現(xiàn)W544F產(chǎn)生的晶體兩個(gè)頂點(diǎn)間的垂直距離比野生型CrylAc約長(zhǎng)0.6μm，且晶體表面不及野生型光滑；此外，W544F與野生CrylAc的殺蟲(chóng)活性相似，但經(jīng)過(guò)紫外光照射9h后，其保留的殺蟲(chóng)活性比野生型高4倍以上。W544F突變較好地解決了CrylAe毒素蛋白在田間應(yīng)用的不穩(wěn)定性問(wèn)題。4.4定點(diǎn)突變技術(shù)提高植酸酶的穩(wěn)定性有學(xué)者對(duì)E.colipH12.5酸性磷酸酶進(jìn)行定點(diǎn)突變，用天冬氨酸替代酶蛋白多肽鏈中的幾個(gè)氨基酸殘基，增加酶分子潛在的糖基化位點(diǎn)的數(shù)目。突變體基因在P.pastoris中表達(dá)，得到了糖基化程度、酶活性及熱穩(wěn)定性改變很大的突變體植酸酶。近年來(lái)的研究也表明，單一氨基酸的替換可以改變酶蛋白的熱穩(wěn)定性，尤其是蛋白質(zhì)殘基對(duì)改善熱穩(wěn)定性的作用尤為顯著。5結(jié)語(yǔ)影響蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的因素非常復(fù)雜，通過(guò)研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，特別是三維結(jié)構(gòu)對(duì)于穩(wěn)定性的關(guān)系，采用蛋白質(zhì)工程對(duì)天然蛋白質(zhì)進(jìn)行突變改造，以期獲得目標(biāo)穩(wěn)定性。通過(guò)蛋白質(zhì)設(shè)計(jì)方法對(duì)突變體進(jìn)行篩選，獲得高表達(dá)的突變體，生產(chǎn)適合工業(yè)化應(yīng)用的高穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。目前，相關(guān)的研究正在進(jìn)行中。然而，盡管文章中所提到的一些蛋白質(zhì)工程技術(shù)方法在提高一些蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性上得到了成功的應(yīng)用，但是由于影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素多且復(fù)雜，加之現(xiàn)階段蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的相關(guān)數(shù)據(jù)很少，且蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性和其活性的最適溫度之間的關(guān)系又是一個(gè)大問(wèn)題。因此，蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的研究仍然是現(xiàn)代計(jì)算生物學(xué)家及蛋白質(zhì)工程學(xué)家努力的方向。參考文獻(xiàn)[1]汪世華.蛋白質(zhì)工程[M].北京：科學(xué)出版社，2008.[2]BeheraRK，MazumdarS.ThermodynamicbasisofthethermostabilityofCYPl75A1fromThermusthermophilus[J].Int..J.Bio1.Macromo1.,2010,46(4).[3]陳路清,張秀艷,唐彥捷等.嗜熱酶的穩(wěn)定機(jī)制和穩(wěn)定策略的研究進(jìn)展[J].科技通報(bào),2008,6.[4]DosR，GemteinM．Thestabilityofthermophilicproteins：astudybasedoncomprehensivegenomecomparison[J]．Funct．Integr．Genomics，2000，l(1).[5]KorkegianA，BlackME，BakerD，eta1．．Computationalthermostabilizationofallenzyme[J]．Science，2005，308(5723).[6]ChakravartyS，VaradarajanR．Elucidationoffactobresponsibleforenhancedthermalstabilityofproteins：astructuralgenomicsbasedstudy[J]．Biochemistry(Mosc)．，2002，41(25).[7]HanZL，HanSY，ZhengSP，etu1．．EnhancingthermostabilityofaRhizomucormieheilipasebyengineeringadisulfidebondanddisplayingontheyeastcellsurface[J].Appl．Microbi01．Biotechn01．，2009，85(1).[8]王大成．蛋白質(zhì)工程[M]．北京：科學(xué)出版社，2001．[9]AckermanSH．GattiDL，ThecontributionofcocvolvingresiduestothestabilityofKDO8Psynt