第15章 細胞免疫學(xué)技術(shù)課件

第一節(jié)淋巴細胞的功能檢測一、T細胞功能檢測二、B細胞功能檢測三、NK細胞活性測定第十五章免疫細胞功能檢測技術(shù)第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)第二節(jié)吞噬細胞功能檢測技術(shù)一、中性粒細胞功能檢測二、巨噬細胞功能檢測第三節(jié)免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用思考題小結(jié)第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)

對淋巴細胞群，中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等功能測定可以有效評價機體特異性和非特異性免疫功能。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)第一節(jié)淋巴細胞的功能檢測

淋巴細胞功能測定可分為體內(nèi)實驗和體外實驗。體內(nèi)實驗主要是間接了解淋巴細胞對抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)；體外實驗主要包括淋巴細胞對抗原或有絲分裂原刺激后的增殖反應(yīng)、細胞毒性試驗及淋巴細胞分泌產(chǎn)物的測定第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)淋巴細胞T細胞（負(fù)責(zé)細胞免疫功能）B細胞（執(zhí)行體液免疫功能）NK和K細胞（非特異性免疫作用）第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)一、T細胞功能的檢測T細胞增殖試驗T細胞分泌功能測定T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗體內(nèi)試驗第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)（一）T淋巴細胞增殖試驗1.原理：淋巴細胞DNA合成分化母細胞刺激物細胞變大細胞漿擴大空泡核仁明顯核染色質(zhì)疏松第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)

未轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化淋巴細胞的形態(tài)特征轉(zhuǎn)化的淋巴細胞未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞淋巴母細胞過渡型細胞大小(直徑μm)12～2012～166～8核大小、染色質(zhì)增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1～4個有或無無有絲分裂有或無無無胞質(zhì)、著色增多、嗜堿增多、嗜堿極少、天青色漿內(nèi)空泡有或無有或無無偽足有或無有或無無第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)2.淋巴細胞轉(zhuǎn)化的刺激物非特異性刺激物：

PHA------T細胞

ConA-------T細胞

PWM-------T、B細胞

LPS-------B細胞特異性刺激物：異種抗原同種組織抗原

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)3.檢測方法

形態(tài)法：刺激物淋巴細胞（4-6天）母細胞化同位素法：PHA淋巴細胞（54h）

DNA合成期+3HTdR摻入

收集細胞

檢測β射線

測定細胞內(nèi)的3H－TdR第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)（1）形態(tài)學(xué)檢查法第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)方法學(xué)評價：優(yōu)點：形態(tài)學(xué)方法簡便易行，普通光學(xué)顯微鏡便能觀察結(jié)果，適于基層實驗室應(yīng)用。缺點：是依靠肉眼觀察形態(tài)學(xué)變化，判斷結(jié)果易受主觀因素影響，重復(fù)性和準(zhǔn)確性較差。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)（2）3H-TdR摻入法優(yōu)點：3H-TdR摻入法敏感性高，客觀性強，重復(fù)性好。缺點：但需一定設(shè)備條件，同時還存在放射性核素污染問題。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(二)T細胞分泌功能測定

體外培養(yǎng)的T細胞經(jīng)各種絲裂原或抗原刺激后,分泌各種細胞因子,可借助免疫學(xué)、細胞生物學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)分別檢測細胞因子含量、生物學(xué)活性或基因表達水平，以反映T細胞功能。

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)（三）T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗1.原理：靶細胞抗原T細胞觀察殺傷活力致敏CTL靶細胞第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)形態(tài)學(xué)方法：淋巴細胞+腫瘤細胞計數(shù)殘留腫瘤細胞同位素法：淋巴細胞（CTL）+含51Cr的腫瘤細胞腫瘤細胞破壞51Cr釋放測定γ射線2.方法意義：腫瘤患者CTL殺傷腫瘤細胞的能力

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)圖15-2T細胞細胞毒試驗示意圖第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(四)體內(nèi)試驗特異性抗原皮膚試驗PHA皮膚試驗第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)二、B細胞功能檢測B細胞增殖能力的試驗溶血空斑試驗B細胞抗體形成功能的檢測體內(nèi)試驗第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(一)B細胞增殖能力的試驗抗IgM細菌脂多糖SAC的SPA

B細胞增殖形態(tài)學(xué)3H－TdR摻入法第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(二)溶血空斑試驗1.原理：第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)2.方法學(xué)：經(jīng)典溶血空斑形成試驗被動溶血空斑試驗

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)3．臨床應(yīng)用與評價溶血空斑試驗主要用于測定藥物和手術(shù)等因素對體液免疫功能的影響評價免疫治療或免疫重建后機體產(chǎn)生抗體的能力。

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(三)

B細胞抗體形成功能的檢測

——酶聯(lián)免疫斑點法1.原理：第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)2．應(yīng)用與方法學(xué)評價：該方法既可檢測抗體分泌細胞，又可檢測抗體分泌量。優(yōu)點：穩(wěn)定、特異、抗原用量少；可同時檢測不同抗原誘導(dǎo)的不同抗體分泌，并可定量；可檢測組織切片中分泌抗體的單個細胞。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(四)體內(nèi)試驗體內(nèi)抗體產(chǎn)生的特異性抗原有白喉類毒素、破傷風(fēng)類毒素、多價肺炎鏈球菌菌苗等。將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分別采血，分離血清，測定受檢者免疫前后相應(yīng)抗體的效價，判斷受檢者體內(nèi)B細胞的功能。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)染色計數(shù)離心取上清測LDH或AKP離心取沉淀測活細胞熒光測發(fā)光強度測CPM值形態(tài)法酶釋法熒光法同位素法化學(xué)發(fā)光法三、NK細胞活性測定靶細胞溶解常用靶細胞:

K562細胞株第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)第二節(jié)吞噬細胞功能檢測技術(shù)

吞噬細胞的吞噬活動大體分為趨化、吞噬和胞內(nèi)殺滅作用三個階段，據(jù)此建立相應(yīng)的檢測方法。一、中性粒細胞功能檢測技術(shù)二、巨噬細胞功能檢測技術(shù)第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)吞噬細胞的功能：

趨化

吞噬胞內(nèi)殺滅作用

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)一、中性粒細胞功能的檢測

細胞趨化功能的檢測吞噬和殺菌功能的檢測第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(一)細胞運動功能——趨化功能檢測1.原理：第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)2.方法學(xué)：瓊脂糖平板法

濾膜滲透法（Boyden小室法）第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(二)吞噬和殺菌功能測定1．顯微鏡檢查法：第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)2.溶菌法3．NBT還原試驗

第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)二、巨噬細胞功能檢測(一)炭粒廓清試驗

正常小鼠肝中枯否細胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬細胞約吞噬清除10%炭粒。據(jù)此給小鼠定量靜脈注射印度墨汁(炭粒懸液)，間隔一定時間反復(fù)取靜脈血，測定血中炭粒的濃度，根據(jù)血流中炭粒被廓清的速度，判斷巨噬細胞的功能。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(二)吞噬功能檢測

巨噬細胞對顆粒性抗原物質(zhì)具有很強的吞噬功能，常用雞紅細胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母細胞等作為吞噬顆粒，用斑蟊敷貼法收集人巨噬細胞或從腹腔滲出液獲得鼠巨噬細胞。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(三)巨噬細胞溶酶體酶的測定1．酸性磷酸酶的測定硝酸鉛法偶氮法2．非特異性酯酶的測定常用α-萘醋酸法第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(四)細胞毒作用測定

用IFN-γ激活小鼠巨噬細胞，觀察其對125I-UdR標(biāo)記的DBA/2小鼠肥大細胞瘤P815的殺傷活性。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)(五)巨噬細胞促凝血活性測定

激活的巨噬細胞可產(chǎn)生一種與膜結(jié)合的凝血活性因子，加速正常血漿的凝固，為此取已經(jīng)37℃預(yù)溫的正常兔血漿和CaCl2混合液，加入經(jīng)粘附有單層巨噬細胞的試管中，移置37℃，即時記錄血漿凝固時間。第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)反映機體免疫功能狀態(tài)。腫瘤、免疫缺陷病等疾病的診斷和疾病預(yù)后監(jiān)測。組織器官移植后對受者的細胞免疫學(xué)功能監(jiān)測則有利于排斥反應(yīng)的早期發(fā)現(xiàn)，以便及時采取有效措施。第三節(jié)免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)思考題T細胞功能檢測內(nèi)容有哪些？什么是T細胞增殖試驗的原理、刺激物及方法學(xué)？何謂T細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗的原理和方法學(xué)？何謂結(jié)核菌素皮膚試驗？B細胞功能檢測的方法學(xué)有哪些？何謂溶血空斑試驗的原理和方法學(xué)？NK細胞活性測定的方法學(xué)有哪些？中性粒細胞功能檢測方法學(xué)及相應(yīng)原理。巨噬細胞功能檢測方法學(xué)及相應(yīng)原理。免疫細胞功能檢測的臨床應(yīng)用有哪些？第15章細胞免疫學(xué)技術(shù)小結(jié)免疫細胞功能試驗包括體內(nèi)和體外試驗。免疫細胞功能體外試驗主要根據(jù)免疫細胞的增殖活性、分泌活性和殺傷活性等特性而進