疾病的分子生物學(xué)

疾病的分子生物學(xué)11/2/20241

目前認(rèn)為發(fā)病既有遺傳基礎(chǔ)，又有環(huán)境因素，遺傳因素提供了疾病產(chǎn)生的遺傳背景，環(huán)境因素促使疾病表現(xiàn)出相應(yīng)的癥狀和體癥。二者作用的大小則要具體分析，如圖。遺傳因素環(huán)境因素

123411/2/20242

1、遺傳因素決定發(fā)?。哼z傳因素起主導(dǎo)作用。.如先天聾啞、甲型血友病等。

2、基本由遺傳因素決定發(fā)?。涵h(huán)境因素起誘導(dǎo)作

用，如：突變

苯丙酮尿癥PKU————苯丙氨酸羥化酶缺乏

PAH

高苯丙氨酸飲食誘發(fā)疾病。

3、遺傳和環(huán)境雙重影響發(fā)病——多基因病。

取決于遺傳度，如：哮喘，遺傳度（率）80%，遺

傳因素大，環(huán)境因素小。

消化性潰瘍遺傳度（率）30%~40%，遺傳因素

小，環(huán)境因素大

4、基本由環(huán)境因素決定

如外傷、人為因素。11/2/20243遺傳病的主要類(lèi)型

Thehereditarydisease'smaintype

從遺傳學(xué)角度分類(lèi)，遺傳病包括：1、單基因病

涉及一對(duì)主基因所導(dǎo)致的疾病。

AR——先天聾啞

AD——并指、多指癥

XR——紅綠色盲血友病DMDXD——抗VD佝僂病2、多基因病

涉及多對(duì)（二對(duì)以上）基因和環(huán)境共同作用所導(dǎo)致的疾病。如；唇裂、精神分裂癥、高血壓等。

11/2/202443、染色體病染色體異常引起的疾病。常染色體——21三體綜合征數(shù)目異常性染色體——Turner綜合征常染色體——5p-，貓叫綜合征結(jié)構(gòu)異常

性染色體——脆性X染色體綜合征4、體細(xì)胞遺傳病——腫瘤5、線粒體病——Leber視神經(jīng)病（C核外基因組）11/2/20245

一．染色體病Chromosomedisease

概念：由于染色體的數(shù)目、結(jié)構(gòu)畸變所引起的疾病就稱(chēng)為染色體病。染色體是基因的載體，共有24種染色體：包括1～22號(hào)常染色體和X、Y染色體，其中含有2～2.5萬(wàn)個(gè)基因、2.85х109bp(基因組)。最大的1號(hào)染色體約有250Mb，最小的21號(hào)染色體約有50Mb，可見(jiàn)一個(gè)染色體上有上千個(gè)基因。染色體除了DNA以外還有RNA、組蛋白、非組蛋白等組成。11/2/20246染色體數(shù)目改變、微小結(jié)構(gòu)畸變都能引起許多基因增加或缺失，結(jié)果導(dǎo)致染色體綜合癥。染色體綜合癥的主要表現(xiàn)是:多發(fā)畸形、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩、智力低下，特征性皮紋改變等。目前記載已有100多種染色體綜合癥。11/2/20247染色體異常的臨床后果

1、自發(fā)流產(chǎn)在流產(chǎn)兒中進(jìn)行染色體研究表明，大約50%或更多的自發(fā)流產(chǎn)兒有嚴(yán)重的染色體異常。幾乎涉及到所有的染色體，但較為集中在某些染色體的改變。如X染色體、13、18、14、和21。包括三體性、三倍體、四倍體、及單倍體等。11/2/202482、出生缺陷

染色體異常的第二大臨床后果是出生缺陷，染色體的改變不同，臨床表現(xiàn)也不盡相同。

但普遍的特點(diǎn)是：生長(zhǎng)發(fā)育遲緩（growthretardation），智力低下（mentalretardation）和特征性異常體征（specificsomaticabnormalities）。

11/2/202491.人類(lèi)染色體：每一種生物都具有恒定的染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)。一個(gè)體細(xì)胞中全部染色體組成就稱(chēng)為核型，人的正常男性核型為46，xy

，正常女性核型為46，xx.。

1）

染色體分析技術(shù)：

染色體顯帶技術(shù)

①Q(mào)顯帶(Qbanding)---1968年建立，用熒光染料處理后，在熒光顯微鏡下觀察，可見(jiàn)明暗交替的帶。11/2/202410

②

G顯帶---1971年建立，用胰蛋白酶處理后，Giemsa染色，可見(jiàn)深淺交替的帶，Q帶的亮帶處正好是G帶的深染處。③

R帶---鹽溶液（磷酸二氫鈉等）處理后，Giemsa染色，深淺帶正好與G帶相反。一般用于觀察染色體末端。④C帶---用氫氧化鈉或氫氧化鋇預(yù)處理后，Giemsa

染色，結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)（著絲粒、副縊痕、Y染色體長(zhǎng)臂等）染成深色。11/2/202411顯帶方法：

G-顯帶：是最常用的方法。標(biāo)本經(jīng)胰蛋白酶處理后，應(yīng)用Giemsa染色，鏡檢、分析,顯示深染和淺染相間的帶紋。11/2/202412G-banging界標(biāo)、區(qū)和帶11/2/202413染色體高分辨顯帶(highresolutionbandingchromosome,HRBC)：

70年代后期建立，一般顯帶是320條帶，HRBC是550條帶----850條----1000多條。在細(xì)胞分裂晚前期、早中期收集染色體，獲得更長(zhǎng)的染色體，然后顯帶。11/2/20241411/2/202415※

人類(lèi)細(xì)胞遺傳學(xué)研究新進(jìn)展：（1）微細(xì)胞遺傳學(xué)---應(yīng)用HRBC技術(shù)研究染色體微細(xì)結(jié)構(gòu)改變與遺傳效應(yīng)之間的相關(guān)性。一般能檢測(cè)到4500Kb以上的DNA改變。（2）

分子細(xì)胞遺傳學(xué)---近年來(lái)進(jìn)展快，以分子水平研究染色體結(jié)構(gòu)畸變遺傳效應(yīng)、疾病。11/2/202416原位雜交熒光原位雜交（FISH），把某一DNA片斷（探針）精確定位到染色體特定區(qū)帶。染色體涂染---染色體特異性DNA作為探針池（某號(hào)染色體、或某區(qū)帶染色體），用非同位素標(biāo)記（如生物素），與靶細(xì)胞染色體進(jìn)行原位雜交，以帶有熒光的抗生物素蛋白進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)后檢測(cè)特異區(qū)段的熒光雜交信號(hào)。染色體易位檢測(cè)時(shí)用兩種不同染色體涂染不同染色體。11/2/2024171/單色FISH

11/2/2024182/多色FISH（24種染色）11/2/20241921三體FISH診斷11/2/202420核型11/2/202421比較基因組雜交（Comparativegenomichybridization,CGH）

待測(cè)基因組DNA和正常參照基因組DNA，分別用不同的非同位素標(biāo)記（切口平移法、隨機(jī)引物法），以1：1混合制成探針，在正常人外周血染色體標(biāo)本上進(jìn)行原位抑制雜交，分別以不同熒光染料標(biāo)記的蛋白進(jìn)行檢測(cè)。11/2/202422

例如：正常DNA與紅色熒光染料結(jié)合，腫瘤與綠色結(jié)合，那么紅（正常）/綠（腫瘤）熒光比值定量檢測(cè)（用電腦彩色圖像分析系統(tǒng)），由此判斷腫瘤DNA的擴(kuò)增或缺失等基因拷貝數(shù)的變化11/2/2024232.

染色體機(jī)能、轉(zhuǎn)錄活性以及染色體結(jié)構(gòu)之間的關(guān)系哺乳動(dòng)物染色體有如下兩個(gè)生物學(xué)功能：（1）保持遺傳物質(zhì)恒定---DNA復(fù)制后經(jīng)有絲分裂均分。（2）世代傳遞時(shí)（減數(shù)分裂）來(lái)自于雙親的同源染色體之間發(fā)生互換，使遺傳物質(zhì)重組（父母親的）。11/2/202424染色體的機(jī)能依賴(lài)于著絲粒、端粒、復(fù)制起點(diǎn)三種元件，在酵母人工染色體的制備成功就說(shuō)明這一點(diǎn)。酵母人工染色體（Yestartificialchromosome,YAC）---具有相當(dāng)于有功能的著絲粒、兩個(gè)端粒、復(fù)制起點(diǎn)的特殊的克隆載體，能克隆200~2000Kb長(zhǎng)度。

著絲粒---細(xì)胞分裂時(shí)姐妹染色單體之間分離，同源染色體之間分離起重要作用，沒(méi)有著絲粒的染色體片斷在分裂中丟失。有多個(gè)染色體特異的DNA序列組成，結(jié)構(gòu)很復(fù)雜。11/2/202425

端粒---由DNA和蛋白質(zhì)組成的特殊結(jié)構(gòu)，位于真核生物染色體末端。其作用是：

①保持染色體的完整---失去端粒后染色體末端非常不穩(wěn)定，容易與其他染色體切斷形成的切端之間融合相接形成易位染色體。端粒結(jié)合蛋白能識(shí)別端粒3’突出末端，起保護(hù)作用。②保證染色體末端DNA復(fù)制的完全，復(fù)制到DNA鏈終端。11/2/202426③維持核內(nèi)三維結(jié)構(gòu)及對(duì)染色體配對(duì)起作用（染色體末端限局性存在于核周邊）端粒的結(jié)構(gòu)---進(jìn)化過(guò)程中高度保守，由高度重復(fù)序列組成，在人類(lèi)是由(TTAGGG)n組成，在端粒酶的作用下復(fù)制。端粒酶（telomerase）---由RNA和蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，以核內(nèi)RNA為模板合成DNA的反轉(zhuǎn)錄酶（細(xì)胞內(nèi)以RNA為模板合成DNA，延伸端粒中富含TG的DNA領(lǐng)頭鏈，以DNA聚合酶合成另一條鏈，因此總是有3’突出單鏈末端），端粒的長(zhǎng)度由遺傳控制。

11/2/20242711/2/202428

復(fù)制起點(diǎn)---開(kāi)始DNA復(fù)制的位點(diǎn)，維持染色體拷貝數(shù)。在哺乳動(dòng)物數(shù)十個(gè)Kb間有個(gè)開(kāi)始復(fù)制起點(diǎn)，由復(fù)制起始的特異序列組成。一個(gè)細(xì)胞周期只復(fù)制一次，即復(fù)制一次分裂一次。轉(zhuǎn)錄活性與染色體結(jié)構(gòu)相關(guān)---細(xì)胞分裂間期染色質(zhì)可以分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，常染色質(zhì)著色淺，螺旋化程度低，有轉(zhuǎn)錄活性。11/2/202429

異染色質(zhì)可以分為功能異染色質(zhì)和結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)，X染色質(zhì)屬于功能異染色質(zhì)（發(fā)育過(guò)程中選擇性地凝縮形成）。

結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)是在各種細(xì)胞中總是處于凝縮狀態(tài)，是高度重復(fù)的DNA，沒(méi)有轉(zhuǎn)錄活性，常見(jiàn)于著絲粒、端粒，維持染色體的結(jié)構(gòu)有關(guān)。目前FISH研究結(jié)果看到人類(lèi)基因80%位于R帶，僅有20%位于G帶，CpG島多數(shù)在R帶，mRNA首先結(jié)合于R帶。11/2/202430

X和Y染色體---Y染色體上SRY基因決定男性性別，盡管有兩個(gè)以上X染色體但只要有Y染色體其表型為男性。X和Y染色體在減數(shù)分裂時(shí)配對(duì)，兩者的短臂末端具有同源性，稱(chēng)為擬常染色質(zhì)區(qū)，是減數(shù)分裂時(shí)配對(duì)的部位。11/2/202431Lyon假說(shuō)1.女性?xún)蓷lX染色體中一條處于異固縮狀態(tài)——X染色質(zhì)（Barrbody）。2.胚胎發(fā)育早期—第16天。3.異固縮染色體是隨機(jī)的。11/2/202432需要說(shuō)明的問(wèn)題1）如果一個(gè)有缺失的X染色體，優(yōu)先失活；2）常染色體和X染色體平衡易位的個(gè)體中，正常的X染色體優(yōu)先失活；3）Xchr上的Gene不全部失活，部分gene逃避失活，已知>16個(gè)基因逃避失活；4）體細(xì)胞X失活是永久的，但在生殖細(xì)胞發(fā)育中，失活是可逆的；5）C中只有一條X染色體有活性，其他均以失活狀態(tài)存在；11/2/202433

3.染色體異常與疾病

概念：由于染色體數(shù)目異?；蚪Y(jié)構(gòu)異常引起的疾病就稱(chēng)為染色體病。

數(shù)目異常：整倍體---染色體整組的變化，即3n、4n，常見(jiàn)于夭折的胚胎或腫瘤細(xì)胞中，這樣的個(gè)體即使生下來(lái)也不能生存很長(zhǎng)時(shí)間。非整倍體---不是整組的變化而是某號(hào)染色體增或減，2n+1,2n-1的改變?！鴶?shù)目異常產(chǎn)生原因---染色體不分離，染色體丟失，核內(nèi)復(fù)制。還有雙受精。11/2/202434▲單親二倍體---所有染色體來(lái)自父或母單方的二倍體，在胚胎時(shí)夭折，父源的就形成葡萄胎，母源的就形成卵巢畸胎瘤。這是由于遺傳印記，即父源的和母源的基因表達(dá)不同，二倍體都來(lái)自單親的就不可能發(fā)育成個(gè)體?！?/p>

單親二體型---一對(duì)同源染色體都來(lái)自父或母方，一般三體型丟失一條后其數(shù)目正常，但都來(lái)自于單親。11/2/202435結(jié)構(gòu)異常：染色體斷裂以后形成的斷片變位重接就產(chǎn)生各種結(jié)構(gòu)異常。包括缺失、重復(fù)、倒位、易位、插入、環(huán)狀染色體、雙著絲粒染色體等。一般4Mb以上的改變才能被識(shí)別（光鏡下）。染色體?。悍譃槌Ｈ旧w病和性染色體病。

常染色體病---由于常染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常引起的病，最常見(jiàn)的是唐氏綜合癥（Downsyndrome,DS，21三體，先天愚型）。

性染色體病---由于性染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常引起的疾病，最常見(jiàn)的是Turner綜合癥、Klinfilter綜合癥。其次是脆性x染色體綜合癥。11/2/202436DownSyndrome11/2/202437Down（唐氏）綜合征患者11/2/20243811/2/20243911/2/20244011/2/202441脆性X染色體綜合征（fragileXchromosome，fraX）

該基因定位于Xq27.3，染色體呈細(xì)絲樣，易斷裂—脆性部位。該病主要男性發(fā)病，發(fā)病率高（僅次于21三體），發(fā)病率為男性的1/1250。臨床癥狀—智力低下（中度），頭大，長(zhǎng)臉，下頜大，大耳，大睪丸，語(yǔ)言障礙。近年分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展：克隆分離FMRIgene（主要在腦中表達(dá)）

Xq27.338kb17個(gè)外顯子11/2/20244211/2/202443發(fā)病機(jī)制：

5’端第1外顯子非編碼順序中存在（CGG）n。正常狀態(tài)n=6～46，當(dāng)n〉52減數(shù)分裂時(shí)不穩(wěn)定傳遞過(guò)程中重復(fù)拷貝數(shù)增加前突變（premutation）n=60～2005’

端非甲基化，無(wú)臨床表現(xiàn)（攜帶者）。11/2/202444突變：當(dāng)n〉230，達(dá)數(shù)百，數(shù)千，有臨床癥狀

5’端高度甲基化不穩(wěn)定

轉(zhuǎn)錄停止不同細(xì)胞中n數(shù)不同無(wú)FMR1mRNA及蛋白嵌合體11/2/202445攜帶者大部分是n=50～230（前突變）

FMR1仍有表達(dá)，但傳遞時(shí)不穩(wěn)定，尤其母親傳遞子女更不穩(wěn)定當(dāng)n〈70突變概率20%n〉90突變概率99%女性的突變主要由母親前突變傳來(lái)，而不是父親，在家系傳遞過(guò)程中，拷貝數(shù)逐漸增多，表現(xiàn)為遺傳早現(xiàn)，即隨著傳代發(fā)病年齡提早，病情加重。11/2/20244611/2/202447二單基因?。╩onogenicdisease）的分子生物學(xué)

1.單基因遺傳病的概念、種類(lèi)：由一對(duì)基因所決定的性狀或疾病稱(chēng)為單基因遺傳，目前已知約有6000多種，其中約3000多種與疾病相關(guān)。根據(jù)基因的顯隱性、位于1~22號(hào)常染色體上還是X染色體上，把單基因遺傳病分為如下4種：11/2/202448AD---占半數(shù)以上，一般來(lái)講結(jié)構(gòu)蛋白異常，包括完全顯性、不完全顯性、共顯性、不規(guī)則顯性、延遲顯性。AR---約占36%，一般是酶蛋白異常。XR---10%以下。XD---很少11/2/202449常染色體顯性遺傳（AD）例1Huntington?。℉D）雜合體多在30—40歲發(fā)病，致病基因定位于4p16.3。

正常n=25～39（CAG）n擴(kuò)展患者n=42～8111/2/202450

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)(Spinocerebelar

ataxias,SCAs)

神經(jīng)退化性疾病,AD

臨床癥狀—遲發(fā)性共濟(jì)失調(diào)，走路不穩(wěn)，易跌，步態(tài)蹣跚，兩手笨拙，震顫，不能精細(xì)動(dòng)作；喝水嗆；構(gòu)音障礙，眼震顫等。

SCA已發(fā)現(xiàn)有20幾種亞型—基因座異質(zhì)性11/2/202451發(fā)病機(jī)制與三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展的動(dòng)態(tài)突變相關(guān)。例如：SCA1基因編碼區(qū)5’端（CAG）n

正常：n=17~36n〉43時(shí)發(fā)病11/2/202452ⅠⅡⅢⅣⅤ60歲發(fā)病70歲死亡121231234567891066歲死亡45歲發(fā)病62歲死亡50歲發(fā)病56歲死亡45歲發(fā)病26歲死亡19歲發(fā)病1234567891011121314151617181920212223242526272812345678910111213141565歲50歲發(fā)病48歲36歲發(fā)病36歲因肺結(jié)核死亡圖8-16常染色體顯性脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)家系系譜11/2/202453動(dòng)態(tài)突變（dynamicmutation）—某些遺傳性疾病與三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)的擴(kuò)展有關(guān)，三核苷酸重復(fù)拷貝數(shù)在正常情況下有一定的變異范圍，而擴(kuò)展時(shí)就表現(xiàn)為疾病，這種突變不穩(wěn)定，其拷貝數(shù)與病情正相關(guān)。例如：強(qiáng)直性肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（CTG）n3’非編碼區(qū)脆性X染色體綜合征（CGG）n5’非編碼區(qū)

HD（CAG）n5’編碼區(qū)

SCA（CAG）n5’編碼區(qū)

11/2/202454遺傳印跡（Geneticimprinting）：雙親的基因或染色體存在功能上的差異，因而基因來(lái)自父方或母方而產(chǎn)生不同表現(xiàn)型的現(xiàn)象。這是由于生殖細(xì)胞分化過(guò)程中受到不同修飾的結(jié)果。例如：15p11-13缺失父源染色體缺失—Prader-will綜合征母源染色體缺失—Angelman綜合征11/2/202455HD

父親遺傳—發(fā)病早（20歲以前）病情嚴(yán)重母親遺傳—約在40歲以后發(fā)病，病情輕早現(xiàn)遺傳（anticipation）：一些遺傳病表現(xiàn)出連續(xù)世代傳遞中發(fā)病年齡提早，病情也加重，這種現(xiàn)象就稱(chēng)為早現(xiàn)遺傳。這與動(dòng)態(tài)突變中三核苷酸拷貝數(shù)的擴(kuò)展程度有關(guān)。11/2/202456※

分子病以及先天性代謝病：

分子?。╩oleculaerdisease）的概念是1949年P(guān)auling首次提出，對(duì)HbS患者的血紅蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，患者和正常人的Hb泳動(dòng)速度不同，考慮是由于Hb的分子結(jié)構(gòu)不同所致，由此提出分子病的概念。11/2/202457分子病包括：血紅蛋白病----異常血紅蛋白?。ńY(jié)構(gòu)異常）約有600多種地中海貧血（合成速率下降）包括α地貧和β地貧。血漿蛋白異常免疫蛋白異常受體蛋白異常酶蛋白異常---先天性代謝病11/2/202458先天性代謝?。哼z傳性酶缺陷導(dǎo)致代謝異常?；蛉毕菝傅鞍桩惓４x異常疾病

例如：苯丙酮尿癥（phenylketonuria,PKU）

苯丙氨酸羥化酶（phenylalaninehydroxyrase,PAH）遺傳性缺陷所致，AR,12q24,發(fā)病率為1/16500，由于PAH基因缺陷苯丙氨酸代謝受阻，導(dǎo)致旁路代謝開(kāi)放副產(chǎn)物累積，造成白化癥（酪氨酸缺乏），苯丙酮尿，智力低下（腦積夜中含有大量的苯丙酮酸等中間代謝產(chǎn)物，使智力發(fā)育受限）。11/2/2024592

X---連鎖隱性遺傳?。撼Ｒ?jiàn)的有血友病、G6PD、DMD、紅綠色盲等。血友病(hemophiliaA)是分子遺傳學(xué)研究基因定位、基因診斷、基因治療中很有意義的疾病，以血友病為例講疾病的認(rèn)識(shí)過(guò)程及疾病的分子生物學(xué)研究過(guò)程。早在第二世紀(jì)被猶太人注意----割禮后出血不止而死亡12世紀(jì)在阿拉伯文獻(xiàn)中有記載19世紀(jì)已注意到出血不止的原因是由于凝血緩慢11/2/202460

1）

19世紀(jì)歷史上最著名的血友病家系---英國(guó)王室出現(xiàn)的血友病，波及歐洲各王室Victoria女王（1820~1901），8歲時(shí)其父去世，被定為王位繼承者，其父母家系中無(wú)血友病病史，后來(lái)研究認(rèn)為是新生的突變。她共生育8個(gè)子女，三個(gè)兒子中一個(gè)是血友病患者，五個(gè)女兒中兩個(gè)是攜帶者，她們的女兒分別嫁到俄羅斯、德國(guó)、西班牙等多個(gè)歐洲國(guó)家以后生了血友病兒子。結(jié)果現(xiàn)今英女王是Vctoria正常兒子的后裔，因此其后代中無(wú)血友病患者，英國(guó)王室不再受血友病之害，然而通過(guò)攜帶者女兒把血友病傳遞到歐洲多個(gè)王室。11/2/2024612）

20世紀(jì)Mendel遺傳規(guī)律的應(yīng)用----發(fā)現(xiàn)血友病是XR,男性患者，女性攜帶者。3）

1911~1937年----探索血友病凝血缺陷的早期努力通過(guò)臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)血友病患者的血液----凝血時(shí)間延長(zhǎng)，但不清楚是凝血第幾因子的缺乏。4）

1950~1983年----命名因子Ⅷ，并分離出來(lái)11/2/2024621962年明確A型是第Ⅷ因子缺乏，B型是第Ⅸ因子缺乏所致。血友病中5/6是A型，1/6是其他因子缺乏，其中主要是B型。

※凝血瀑布假說(shuō)----1965年取得很大進(jìn)展

FⅧ是一個(gè)輔助因子，凝血過(guò)程中FⅧ增強(qiáng)了FⅨa因子對(duì)FⅩ因子激活的作用，可見(jiàn)在臨床上A型與B型無(wú)法區(qū)別。11/2/202463血液凝固的級(jí)聯(lián)式過(guò)程11/2/2024644）、凝血機(jī)制缺乏FⅧ或FⅨ都會(huì)引起FⅩ活化減少，繼發(fā)凝塊形成缺陷，從而出現(xiàn)血友病表現(xiàn)。

外原性途徑內(nèi)原性途徑

ⅫⅫaⅪ

組織因子ⅩⅪaⅨⅨaⅧⅧaⅦaⅩaⅤ

凝血酶原復(fù)合體Ⅴa

凝血酶原凝血酶

纖維蛋白凝塊纖維蛋白原11/2/202465血友病的治療---人的血漿中FⅧ含量低，因此在動(dòng)物（豬、牛）血中提取輸給患者，可能產(chǎn)生抗體，誘發(fā)其他病，但是救了許多生命。即血漿化學(xué)分離商品化，問(wèn)題是出現(xiàn)了并發(fā)癥，乙肝病毒、艾滋病病毒感染。1979年~1983年之間大部分FⅧ提取物被污染上了HIV，對(duì)于血友病的治療是悲劇性的結(jié)果。后來(lái)用滅活這些病毒的方法有了些好轉(zhuǎn)。11/2/202466※

FⅧ因子和VWD(vonwillebrand’sdisease,血管性假血友病)

VWD是由于VWF（Vonwillebrand’sfactor,血管性假血友病因子）缺乏所致。

VWD是50年代首先被描寫(xiě)的常染色體顯性遺傳病，是由于VWF遺傳性缺陷所致。11/2/202467

VWF—已證明是FⅧ的受體，血漿中FⅧ是大分子復(fù)合物—即小分子量部分的FⅧ促凝活性和大分子量部分的VWF兩者結(jié)合所組成。FⅧ促凝活性（Ⅷ：C）缺乏是血友病A的發(fā)病原因，F(xiàn)Ⅷ促凝活性只占FⅧ復(fù)合物中的1%，具有凝血活性作用，血漿中含量約為50ug/L。Ⅷ：C的正常值為50~150%，小于正常的2%為重型，正常的2~5%為中型，正常的5~25為輕型，正常的25~50為亞臨床型。

VWF基因定位于12P12~Pter,VWD是AD遺傳。1979年才能把FⅧ和VWF純化出來(lái)。11/2/2024685）

1982年~1984年血漿提純

FⅧ提取高純度的FⅧ而獲得專(zhuān)利，隨后設(shè)想能否用生物工程的方法制備FⅧ，既提高產(chǎn)量也可以避免病毒等污染。11/2/202469幾個(gè)研究小組同時(shí)進(jìn)行研究：把純化的FⅧ經(jīng)胰蛋白酶消化成不同的多肽片斷，通過(guò)色譜法分離不同多肽片斷，將多肽片斷進(jìn)行氨基酸測(cè)序，以此為依據(jù)設(shè)計(jì)合成相應(yīng)的寡核苷酸探針（考慮密碼的兼并性），應(yīng)用此探針篩選基因組文庫(kù)，再經(jīng)基因組文庫(kù)步移法克隆全基因?；蛉L(zhǎng)為186Kb,含26個(gè)外顯子。用如上探針篩選肝臟的cDNA文庫(kù)，就能得到FⅧ基因的cDNA。11/2/2024701984年12月在Nature雜志上發(fā)表了如上研究結(jié)果。然后把FⅧcDNA克隆于表達(dá)載體，研究分析基因和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能。FⅧ基因：位于Xq28,全長(zhǎng)186Kb,占X染色體的0.1%,mRNA大小是9.0Kb,含有26個(gè)外顯子和25個(gè)內(nèi)含子，其中第22個(gè)內(nèi)含子長(zhǎng)達(dá)32Kb.11/2/202471FⅧ蛋白：由Cdna推測(cè)的FⅧ蛋白---含19個(gè)aa的信號(hào)肽和2332aa組成，主要在肝臟中合成，分泌時(shí)信號(hào)肽斷開(kāi)后成為成熟的氨基末端，由A1A2BA3C1C2

等區(qū)域構(gòu)成(同源性來(lái)分)。C區(qū)域---FⅧ功能區(qū)，B區(qū)域---由外顯子14編碼，與已知蛋白不同源，在活化的FⅧ中被剪切掉B區(qū)域，推測(cè)可能是被加工后的mRNA反轉(zhuǎn)錄后再整合進(jìn)去的。11/2/20247211/2/2024736)如何檢測(cè)血友病攜帶者血液中FⅧ水平能檢測(cè)大多數(shù)攜帶者，但攜帶者可以有正常的FⅧ水平，最好的方法是基因診斷，1987年首次應(yīng)用RFLP連鎖分析進(jìn)行了首例產(chǎn)前基因診斷。11/2/202474奧大利亞一位醫(yī)生的妻子是個(gè)血友病攜帶者（家族性），當(dāng)他讀了《Nature》雜志上發(fā)表的論文后，來(lái)信懇求作產(chǎn)前基因診斷，經(jīng)過(guò)BclⅠ/RFLP連鎖分析，確定胎兒是正常男性（核型分析判斷性別為男性，連鎖分析判斷未得到帶有致病基因的染色體），其結(jié)果發(fā)表在Lancent雜志上。11/2/202475

內(nèi)含子18中BclⅠ多態(tài)經(jīng)Southern雜交分析結(jié)果，1.2Kb(1165bp)占27%，0.9Kb(879bp)占73%，雜合子頻率2pq=2×0.27×0.73=0.42(一般在RFLP的情況下小于0.5)。11/2/20247611/2/2024777）

1986年首次檢測(cè)引起甲型血友病的點(diǎn)突變

TaqⅠ/RFLPSouthern檢測(cè)（以cDNA為探針）結(jié)果，患者出現(xiàn)異常帶，進(jìn)一步克隆測(cè)序判定，外顯子24中密碼子2209的CGATGA,結(jié)果精氨酸變成了終止密碼。（迄今已發(fā)現(xiàn)80多種點(diǎn)突變、6種插入、7種小缺失、及60多種大缺失。）

11/2/2024788)1987~1992年

PCR技術(shù)的應(yīng)用，檢測(cè)到很多種突變，也檢測(cè)到多種多態(tài)。

9）1992年缺失檢測(cè)

10）神秘的內(nèi)含子22被闡明，其中有2個(gè)小基因，分別叫F8A和F8B，通過(guò)CpG島發(fā)現(xiàn)，其功能還沒(méi)有搞清楚，已被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)中沒(méi)有與該基因閱讀框架相應(yīng)的蛋白質(zhì)。11/2/20247911）1990年~1993年通過(guò)基因工程技術(shù)生產(chǎn)FⅧ---將FⅧ基因重組于表達(dá)載體，把重組體轉(zhuǎn)染到BHK表達(dá)細(xì)胞中，使其表達(dá)產(chǎn)生FⅧ，1~2mg/升。首先在狗中做實(shí)驗(yàn)，然后用于人。第一批接受治療的嚴(yán)重血友病患者，其止血效果非常好，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的不良表現(xiàn)，但后來(lái)注意到幾乎30%的人產(chǎn)生抗體。目前市售的FⅧ有---血漿來(lái)源的FⅧ或FⅧ復(fù)合物、基因工程生產(chǎn)的11/2/20248012）今后前景

①

確定所有突變基因型，又有效阻止這些突變

②

推動(dòng)基因治療

③

解答蛋白產(chǎn)物的三維結(jié)構(gòu)

④

闡明蛋白功能的機(jī)制，研究基因的進(jìn)化

11/2/202481假肥大型肌營(yíng)養(yǎng)不良：

包括Duchennemusculardystrophy,DMD和Beckermusculardystrophy,BMD,都是DMD基因缺陷所致，DMD比BMD癥狀重，發(fā)病年齡早。DMD發(fā)病率為1/3500，是神經(jīng)肌肉系統(tǒng)最常見(jiàn)的遺傳病，XR遺傳。一般5~6歲開(kāi)始發(fā)病，雙下肢無(wú)力，上樓梯困難，Gower征（+），腓腸肌假性肥大，進(jìn)行性肌萎縮，10歲以后不能自主走路，20歲前死于呼吸、循環(huán)衰竭。11/2/202482

部分患兒伴有不同程度的智力低下。生化檢測(cè)---血清磷酸激酶升高（CPK）,乳酸脫氫酶升高（LDH）,肌紅蛋白（Mb）升高。肌電圖---呈典型肌源性疾病改變。11/2/202483三.致病基因的克隆1.

功能克隆Functionalcloning:基因產(chǎn)物能純化的情況下，通過(guò)基因產(chǎn)物的功能分析進(jìn)行基因克隆方法，F(xiàn)Ⅷ基因克隆是功能克隆的典型。

※

蛋白產(chǎn)物精提后經(jīng)胰蛋白酶等消化分解成多肽，把多肽的氨基酸測(cè)序后，合成制備相應(yīng)的寡核苷酸探針（考慮密碼的兼并性），以此來(lái)篩選基因組或者cDNA文庫(kù)。11/2/202484FⅧ蛋白多肽多肽

片段氨基酸測(cè)序合成寡核苷酸探針篩選基因組文庫(kù)基因組文庫(kù)步移法克隆全基因胰蛋白酶消化色譜法分離11/2/202485※

還可以用抗原抗體反應(yīng)來(lái)篩選（蛋白產(chǎn)物經(jīng)免疫產(chǎn)生抗體，標(biāo)記抗體來(lái)尋找全抗原）。

1982年用這種方法克隆了PAH基因。在肝臟中提純PAH酶，消化成多肽片斷以后，以此來(lái)免疫小鼠或小兔，獲得特異性抗體。由肝臟提取mRNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，連接到表達(dá)載體，構(gòu)建cDNA表達(dá)文庫(kù)。用如上特異性抗體經(jīng)同位素標(biāo)記后篩選cDNA表達(dá)載體，確定表達(dá)抗原的克隆?！傊ㄟ^(guò)基因產(chǎn)物的功能分析來(lái)進(jìn)行克隆的方法。11/2/2024862.

定位克?。喊殡S人類(lèi)基因組計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來(lái)的基因定位新策略。其他信息未知的情況下先染色體定位，然后進(jìn)行克隆。染色體定位縮小候選區(qū)域鄰接克隆群中篩選出結(jié)構(gòu)基因經(jīng)篩查突變來(lái)確定疾病相關(guān)基因。11/2/2024871）

染色體定位的方法（范圍較大，通常大于10Mb）（1）

連鎖分析---遺傳病的基因定位常用此法。同過(guò)家系分析尋找lod值3以上的遺傳標(biāo)記，此表記位點(diǎn)就是該基因的候選區(qū)域。11/2/202488（2）雜合性丟失篩選(lossofheterozygosity,LOH)---常用于腫瘤抑制基因的定位。應(yīng)用微衛(wèi)星多態(tài)標(biāo)記（一般經(jīng)過(guò)細(xì)胞遺傳學(xué)分析，染色體缺失好發(fā)部位的多態(tài)標(biāo)記），對(duì)比正常組織與腫瘤組織，尋找腫瘤中好發(fā)雜合性丟失部位。11/2/202489（3）

染色體異常---在一些疾病中伴隨著染色體異常，此異常部位的基因與疾病相關(guān)。例如，DMD中常見(jiàn)到Xp21缺失或該點(diǎn)的易位。1986年成功報(bào)道了DMD基因的定位克隆例子。（此外還有CF、HD、多囊腎、大腸癌、乳腺癌等致病基因），這種方法很費(fèi)事，到1995年末只有50多個(gè)基因用此法進(jìn)行克隆。11/2/202490

2)縮小候選區(qū)域---縮小候選染色體區(qū)域的范圍，用多態(tài)性標(biāo)記對(duì)該區(qū)域作更為精細(xì)的遺傳圖，在這個(gè)過(guò)程中遺傳分析至關(guān)重要，采取交換體分析、連鎖不平衡分析等方法盡可能縮小染色體區(qū)域定位。

11/2/2024913)克隆重疊群(clonecontugs)的連接及篩選目的基因轉(zhuǎn)錄圖構(gòu)建、克隆DNA中識(shí)別基因，主要用CpG島識(shí)別、外顯子捕獲、DNA測(cè)序等方法（尋找外顯子序列特征部分）4)突變篩查確定候選基因(致病基因)※

三個(gè)定位克隆的成功例子（DMDNF1CF）

11/2/202492DMD(Duchennemusculardystrophy)

染色體定位：1982年靠通常的連鎖分析把DMD基因定位于Xp21

染色體分析---少見(jiàn)的女性患者（目前國(guó)際報(bào)道只有20多人女患），其雙親正常、無(wú)家族史，經(jīng)染色體分析發(fā)現(xiàn)都有X染色體和常染色體之間的易位，多個(gè)女患常染色體的斷點(diǎn)不同，而X染色體的斷點(diǎn)正好都在Xp21,從而進(jìn)一步將DMD基因進(jìn)一步定位于Xp21。11/2/202493通過(guò)消減雜交克隆法分離DMD