凝固酶陰性葡萄球菌

凝固酶陰性葡萄球菌致病性分子標(biāo)志物的建立與應(yīng)用姜美娟中國人民解放軍第401醫(yī)院1ppt課件完整1、立題依據(jù)凝固酶陰性葡萄球菌（CoNS）廣泛存在于人體皮膚、黏膜等組織表面，常在血液、痰液、尿液、深靜脈置管等各種標(biāo)本中檢出。文獻(xiàn)報道，1995-1996年美國48個醫(yī)學(xué)中心2596份血標(biāo)本中，CoNS的分離率達(dá)32.2%。盡管血液等無菌體液培養(yǎng)出CoNS臨床意義較大，但據(jù)報道單次血培養(yǎng)CoNS污染的可能性仍高達(dá)85%。第一部分研究背景和意義2ppt課件完整近年來由于介入性診療操作、免疫抑制劑及廣譜抗生素的廣泛使用，CoNS已成為院內(nèi)感染的重要病原菌，而且耐藥菌株比金黃色葡萄球菌更為多見。葉聯(lián)華等報道人工瓣膜術(shù)后心內(nèi)膜炎中，約有40%-50%由凝固酶陰性葡萄球菌引起；

2009年中國CHINET細(xì)菌耐藥監(jiān)測結(jié)果MRCoNS檢出率平均為71.7%,大于MRSA的52.7%。研究背景和意義3ppt課件完整CoNS作為皮膚黏膜定植菌，在越來越多的標(biāo)本中被分離出來，常常引起臨床困惑。其是否能作為感染的病原菌是臨床關(guān)心的問題。有鑒于此，實驗室建立對CoNS污染菌和致病菌界定的方法十分必要，是臨床明確診斷和制定合理治療方案的重要前提。研究背景和意義4ppt課件完整CoNS致病物質(zhì)在CoNS感染的發(fā)病過程中，細(xì)菌先黏附繼而形成難以清除的生物膜是其最為重要的致病機制；其中CoNS產(chǎn)生的多糖胞間黏附素（polysacchatideintercellularadhesion，PIA）是細(xì)菌生物膜形成聚集階段所必需的物質(zhì)，在感染過程中起重要的作用，是鑒定其致病性的物質(zhì)基礎(chǔ)。

Heilmann等發(fā)現(xiàn)ica操縱子對合成PIA以及在細(xì)菌形成成熟的生物膜中起到非常重要的作用。

研究背景和意義5ppt課件完整ica基因結(jié)構(gòu)ica基因座定位于細(xì)菌染色體，全長3.4kb，包括icaR調(diào)節(jié)基因及串聯(lián)存在的icaA、icaD、icaB和icaC結(jié)構(gòu)基因。其中，icaADBC4個基因構(gòu)成一個操縱子，可以通過檢測icaADBC基因來反映ica操縱子的存在。

icaB不直接參與胞間黏附素的合成,因為重組icaADC就能使細(xì)胞積聚；icaA單獨呈現(xiàn)低的N-乙酰葡糖胺轉(zhuǎn)移酶活性；icaC涉及到把不斷合成的多糖物質(zhì)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞表面；生物膜的形成要求icaD編碼的產(chǎn)物具有最佳活性。

因此,我們選擇了icaD作為本試驗的目的基因片段。研究背景和意義6ppt課件完整獲得CoNS特異的致病性分子標(biāo)志物；確立敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS特異基因診斷方法；能夠準(zhǔn)確鑒定致病性與非致病性CoNS。研究背景和意義2、實驗?zāi)康?ppt課件完整

研究CoNS的生物標(biāo)志物對該菌在醫(yī)院獲得性感染中的臨床微生物學(xué)診斷與鑒定，追蹤傳染源，探索其在醫(yī)院感染中的確切作用和地位、傳播與感染規(guī)律，從而對控制傳播途徑、建立準(zhǔn)確有效的防治措施具有重要實際意義和經(jīng)濟價值。研究背景和意義3、臨床意義8ppt課件完整陰性對照：表皮葡萄球菌ATCC12228，購自中國藥品鑒定所，經(jīng)基因組測序證明其ica操縱子缺失；陽性對照：表皮葡萄球菌1-97-337，瑞金醫(yī)院倪語星教授惠贈，含有完整ica操縱子；待測樣本：自2006年1月至2007年9月，收集我院臨床各科室共114例疑是感染性標(biāo)本。

第二部分材料和方法1、研究對象9ppt課件完整2、主要試劑培養(yǎng)基：哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基、剛果紅瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯增菌液。引物：

SodA引物（5‘-CCITAYICITAYGAYGCIYTIGARCC-3’及

5‘-ARRTARTAIGCRTGYTCCCAIACRTC-3’）；

icaD引物（5‘-AGGCAATATCCAACGGTAA-3’及

5‘-GTCACGACCTTTCTTATATT-3’）；

16SrDNA引物（5‘-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’及

5‘-CCGTCAATTCCATTTRAGTTT-3’）。

材料和方法10ppt課件完整3、主要儀器設(shè)備PCR儀：PTC100PCR儀，美國MJResearchInc.；恒壓恒流電泳儀、電泳槽：DF-C型，北京東方特力科貿(mào)中心；凝膠成像系統(tǒng)：GDS8000，美國UVPInc.；核酸/蛋白定量儀：DU640，美國Beckman；酶標(biāo)儀：美國雷杜，深圳組裝；ATBExpression：法國bioMérieuxInc；生物安全柜：BSC-1500ⅡB2，濟南鑫貝西生物技術(shù)有限公司；全自動快速微生物培養(yǎng)檢測系統(tǒng)：BacT/ALERT3D60，法國bioMérieuxInc；材料和方法11ppt課件完整4、實驗設(shè)計及方法標(biāo)本采集陰、陽性對照菌種鑒定PIA檢測PCR擴增icaD基因sodA基因16SrDNA序列生物膜形成實驗DNA測序、生物信息學(xué)分析確定特征片段臨床驗證比較分析材料和方法12ppt課件完整圖2.1：部分樣品剛果紅試驗結(jié)果34

1、剛果紅試驗第三部分結(jié)果和討論13ppt課件完整表2.1:114例CoNS的菌種組成及剛果紅試驗結(jié)果結(jié)果和討論14ppt課件完整剛果紅試驗通過培養(yǎng)48h后菌落的顏色變化來反映CoNS表達(dá)多糖胞間黏附素的情況，進而間接地反映其致病性。114例樣品中剛果紅試驗陽性率21.1%，由于CoNS分泌的PIA在培養(yǎng)過程中可以丟失，使陽性結(jié)果偏低；另外，其方法學(xué)本身易于受多種因素影響，比如：蔗糖的濃度、氯化鈉和瓊脂的濃度、氣體條件等，干擾了實驗結(jié)果的正確性，不能滿足臨床要求。

結(jié)果和討論15ppt課件完整2、icaD基因片段的擴增

a

b

cdefg20001000500250(bp)圖2.2：部分樣品的icaD基因片段的PCR擴增結(jié)果結(jié)果和討論16ppt課件完整表2.2:114例CoNS不同菌種icaD片段PCR擴增的結(jié)果

結(jié)果和討論17ppt課件完整

結(jié)果和討論18ppt課件完整圖2.3:部分樣品的定性黏附性實驗結(jié)果

3、體外黏附性實驗

結(jié)果和討論19ppt課件完整

表2.4:9例icaD（+）菌株半定量黏附性實驗結(jié)果

結(jié)果和討論20ppt課件完整通過體外半定量黏附實驗測得88.9%（8/9）icaD（+）菌株是粘附株。可見以半定量黏附試驗結(jié)果作為生物膜形成能力的判定標(biāo)準(zhǔn)，ica操縱子的存在與CoNS粘附及其生物膜形成密切相關(guān)。體外黏附性實驗用光吸收原理檢測生物膜成分，但生物膜本身的結(jié)構(gòu)會受到破壞；且由于方法比較復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制實驗條件才能獲得較好的重復(fù)性，不適合臨床常規(guī)應(yīng)用。

結(jié)果和討論21ppt課件完整4、16SrDNA及sodA基因片段擴增a

b

cde

20001000500100(bp)圖2.5：部分樣品的16SrDNA片段PCR擴增結(jié)果

結(jié)果和討論22ppt課件完整

圖2.6：部分樣品的sodA片段PCR擴增結(jié)果a

b

cde20001000500250(bp)

結(jié)果和討論23ppt課件完整圖7：部分樣品sodAPCR擴增產(chǎn)物的測序圖譜

結(jié)果和討論24ppt課件完整

37例CoNS樣品進行了16SrDNA基因及sodA基因片段的PCR擴增，電泳檢測結(jié)果顯示全部樣品均能準(zhǔn)確地擴增出相應(yīng)的片段，其片段大小分別為16SrDNA926bp及sodA482bp，且均為單一條帶；序列測定表明所有樣品16SrDNA及sodAPCR產(chǎn)物序列均相同，未發(fā)現(xiàn)與感染相關(guān)的特異性分子序列。

結(jié)果和討論25ppt課件完整ica操縱子可出現(xiàn)在多種CoNS中，臨床實驗室建立并常規(guī)進行CoNS致病性分子標(biāo)志物的檢測方法是有意義、有必要的；通過本實驗我們確立了的敏感、準(zhǔn)確、快速的醫(yī)院感染相關(guān)性CoNS基因診斷新方法，即icaD基因擴增方法；

第四部分結(jié)論26ppt課件完整結(jié)論本研究首次報道了除表皮葡萄球菌以外的其他種的凝固酶陰性葡萄球菌產(chǎn)生多糖胞間粘附因子的情況；表皮葡萄球菌在臨床CoNS中檢出最多，是攜帶icaD操縱子的主要菌種，其致病性應(yīng)引起足夠重視；27ppt課件完整結(jié)論16SrDNA以及sodA基因可作為鑒定CoNS的基因標(biāo)記