第八章-免疫學(xué)應(yīng)用(二)

第八章免疫學(xué)的臨床應(yīng)用（二）免疫預(yù)防免疫治療免疫診斷免疫學(xué)診斷一、抗原或抗體的檢測二、淋巴細胞的測定免疫學(xué)診斷（一）抗原抗體反應(yīng)的原理免疫學(xué)診斷一、抗原或抗體的檢測1、抗原抗體反應(yīng)的特異性（1）特異性：基于兩種分子間的結(jié)構(gòu)互補性和親和性。（2）可逆性（3）適宜的條件：電解質(zhì)、pH、溫度等2、抗原抗體反應(yīng)的可見性抗原抗體按適當比例結(jié)合，形成肉眼可見的現(xiàn)象。應(yīng)用1、利用已知抗原檢測未知抗體（1）檢測病原微生物的相應(yīng)抗體以輔助診斷疾?。簜?、流行性乙型腦炎、AIDS病等。（2）檢測自身抗體——診斷自身免疫病：SLE、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等2、利用已知抗體檢測未知抗原（1）鑒定病原菌：診斷疾?。?）檢測腫瘤相關(guān)抗原：檢測甲胎蛋白以診斷肝癌（3）檢測血型抗原、HLA抗原：鑒定血型，親子鑒定（4）檢測藥物半抗原：確認運動員是否服用興奮劑（二）抗原或抗體的檢測方法凝集反應(yīng)沉淀反應(yīng)免疫標記技術(shù)

（一）凝集反應(yīng)（agglutination）

顆粒性抗原（紅細胞、細菌、乳膠顆粒等）與抗體特異性結(jié)合，形成肉眼可見的凝集塊。1、直接凝集(directagglutination)

玻片凝集、試管凝集2、間接凝集（indirectagglutination）

可溶性抗原包被在乳膠顆?；蚣t細胞表面，與相應(yīng)抗體混合出現(xiàn)的凝集現(xiàn)象。3、抗球蛋白試驗（Coomb)乳膠顆粒紅細胞類風(fēng)濕因子檢測妊娠試驗間接凝集直接凝集（二）沉淀反應(yīng)（precipitation）

可溶性抗原（免疫球蛋白、細胞裂解物、組織浸液等）與相應(yīng)抗體結(jié)合，形成不溶性免疫復(fù)合物，出現(xiàn)不透明的沉淀物。多在半固體瓊脂凝膠上進行，形成白色的沉淀?？煞譃閱蜗蛎庖邤U散試驗、雙向免疫擴散試驗、免疫電泳、免疫比濁法等。免疫比濁法：快速簡便。用于血清IgG、IgA、IgM、補體C3、C4含量測定

用標記物標記抗體或抗原進行抗原抗體反應(yīng)借以提高免疫學(xué)診斷的敏感性熒光素：異硫氰酸熒光素（黃綠色熒光）、藻紅蛋白、羅丹明（紅色熒光）放射性同位素：125I、131I酶：辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶免疫熒光檢測法（IFA）放射免疫檢測法（RIA）酶免疫檢測法（EIA）

（三）免疫標記技術(shù)液相（ELISA）、固相（免疫組化技術(shù)）直接熒光法間接熒光法免疫熒光技術(shù)間接法雙抗夾心法競爭法E:辣根過氧化酶HRPS:底物二氨基聯(lián)苯胺DAB/鄰苯胺酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA法）間接法DAB雙抗夾心法DABBAS-ELISA法（

biotin-avidin-system，生物素-抗生物素系統(tǒng)-ELISA法）：敏感性更高。用于抗原抗體以及DNA、RNA的檢測。卵白及某些微生物中的蛋白質(zhì)

靈敏度達pg水平。常用于微量物質(zhì)測定，如胰島素、生長激素、甲狀腺素、孕酮等激素、嗎啡、地高辛等藥物以及IgE等。放射免疫檢測法（RIA）競爭法能分離分子大小不同的蛋白質(zhì)并確定其分子量，常用于檢測多種病毒的抗體或抗原，如抗HIV抗體的檢測。免疫印跡法膠體金斑點免疫層析試驗

抗HCG免疫金復(fù)合物干片粘貼在近下端C處，抗HCG單克隆抗體和抗小鼠IgG抗體分別固化于醋酸纖維素膜的檢測區(qū)T處和對照區(qū)R處。當試紙條下端B處浸入液體標本中，下端吸水材料即吸取液體液體向上端移動，流經(jīng)干片C處時，使免疫金復(fù)合物復(fù)溶，并帶動其向膜條滲移。若標本中有HCG，可與C處抗HCG免疫金復(fù)合物結(jié)合。此抗原抗體復(fù)合物流至測試區(qū)時即被固相抗體所獲，在T處顯出紅色反應(yīng)線條。過剩的免疫金復(fù)合物繼續(xù)前行，至質(zhì)控參照區(qū)R處與固相抗小鼠IgG結(jié)合（免疫金復(fù)合物中的單克隆抗體為小鼠IgG），而呈現(xiàn)出紅色質(zhì)控線條。反之，陰性標本則無反應(yīng)線條，而僅顯示質(zhì)控線條。膠體金斑點免疫層析試驗原理操作及結(jié)果判定

二、淋巴細胞的測定（一）淋巴細胞的分離與類型鑒定1、淋巴細胞的分離：外周血葡聚糖-泛影葡胺密度梯度離心法白膜層單核細胞淋巴細胞BT吸附分離過尼龍毛柱分離（1）間接免疫熒光法：鑒定細胞的群、亞群。用CD3、CD4、CD8單克隆抗體檢測患者外周血T細胞表面相應(yīng)抗原CD3+——T細胞，計算T細胞總數(shù)。

CD4+——CD4+T細胞，計算CD4+T細胞數(shù)。

CD8+——CD8+T細胞，計算CD8+亞群T細胞數(shù)

計算CD4+/CD8+比例

正常人PMB中T細胞占65~75%CD4+

/CD8+約為1.5~22、淋巴細胞的類型鑒定：淋巴細胞表面標記檢測、記數(shù)用mIgM、mIgD單克隆抗體檢測患者外周血B細胞表面相應(yīng)的抗原已檢測B細胞的數(shù)量正常人外周血中SmIg+

細胞占8~12%（2）流式細胞術(shù)（flowcytometry）

（二）淋巴細胞功能測定1、T細胞功能測定（1）T細胞增殖試驗（淋轉(zhuǎn)）：絲裂原、抗CD3單克隆抗體等能非特異地激活T細胞，使之發(fā)生轉(zhuǎn)化增殖，計算淋巴母細胞轉(zhuǎn)化率（正常值65~80%）。①形態(tài)學(xué)觀察法②3H-TdR滲入法：用液體閃爍儀測定樣品的β射線放射活性③MTT法（2）淋巴細胞介導(dǎo)的細胞毒試驗（LMC）

——檢測CTL、NK、LAK、TIL細胞殺傷靶細胞的功能淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗T細胞PHA淋巴母細胞（體積增大，形態(tài)不整齊，核大，松散，有核仁，胞漿變寬，出現(xiàn)空泡）刀豆素A(ConA）美洲商陸（PWM）

分型：小淋巴細胞：核質(zhì)密、胞漿小、無核仁過渡型：比小淋巴細胞略大、核質(zhì)略疏松，出現(xiàn)核仁淋巴母細胞：大4～5倍，核質(zhì)疏松，核仁1～3個，核周淡染的透明區(qū)，胞漿網(wǎng)狀可見空泡分裂相：染色體型方法：外周血+PHA→混勻，37℃72小時→取培養(yǎng)液涂片染色、鏡檢，分別計數(shù)轉(zhuǎn)化細胞（淋巴母細胞、過渡型母細胞和核有絲分裂相細胞）和成熟的淋巴細胞，共計數(shù)200個細胞。并計算轉(zhuǎn)化率。轉(zhuǎn)化率﹦轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)+未轉(zhuǎn)化的淋巴細胞數(shù)×100%正常成人轉(zhuǎn)化率為：60%~80%，﹤50%視為降低E玫瑰花環(huán)實驗

（Erythocyte)TcellCD2（SRBCreceptor）結(jié)果判斷及意義結(jié)果判斷：圍繞≥3個綿羊紅細胞為陽性E花環(huán)形成率=正常值：40%-70%意義：反映T細胞的數(shù)量E花環(huán)形成陽性+E花環(huán)形成