分子生物學(xué)3生物信息的傳遞（上）-從DNA到RNA

分子生物學(xué)3生物信息的傳遞（上）——從DNA到RNA第三章生物信息的傳遞（上）——從DNA到RNA重點(diǎn)：1.啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始2.原核生物和真核生物mRNA的特征比較3.內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾難點(diǎn)：1.啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始2.終止和抗終止3.內(nèi)含子的剪接、編輯及化學(xué)修飾第四節(jié)啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄起始大腸桿菌RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用主要包括啟動(dòng)子區(qū)的識(shí)別、酶與啟動(dòng)子的結(jié)合及因子的結(jié)合與解離等。1.原核啟動(dòng)子的基本結(jié)構(gòu)（1）啟動(dòng)子：是一段位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游區(qū)的DNA序列，能活化RNA聚合酶，使之與模板DNA準(zhǔn)確的相結(jié)合并具有轉(zhuǎn)錄起始的特異性?；虻奶禺愋赞D(zhuǎn)錄取決于酶與啟動(dòng)子能否有效地形成二元復(fù)合物，所以，RNA聚合酶如何有效地找到啟動(dòng)子并與之結(jié)合是轉(zhuǎn)錄起始過程中首先要解決的問題。我們知道，轉(zhuǎn)錄的起始是基因表達(dá)的關(guān)鍵階段，而這一階段的重要問題是RNA聚合酶與啟動(dòng)子的相互作用。啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)影響了它與RNA聚合酶的親和力，從而影響了基因表達(dá)水平。（2）轉(zhuǎn)錄單元：是一段從啟動(dòng)子開始至終止子結(jié)束的DNA序列。RNA聚合酶從轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)開始沿著模板前進(jìn)，直到終止子為止，轉(zhuǎn)錄出一條RNA鏈。在細(xì)菌中，一個(gè)轉(zhuǎn)錄單元可以是一個(gè)基因，也可以是幾個(gè)基因(3)轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)：是指與新生RNA鏈地一個(gè)核苷酸相對(duì)應(yīng)DNA鏈上的堿基。常常把起點(diǎn)前面，即5′末端的序列稱為上游，而把其后面即3′末端的序列稱為下游。在描述堿基的位置時(shí)，一般用數(shù)字表示，起點(diǎn)為+1，下游方向依次為+2、+3等，上游方向依次為-1、-2、-3等。啟動(dòng)子區(qū)是RNA聚合酶的結(jié)合區(qū)，其結(jié)構(gòu)直接影響到轉(zhuǎn)錄的效率。那么，啟動(dòng)子區(qū)有什么結(jié)構(gòu)特點(diǎn)呢？（4）絕大部分原核啟動(dòng)子都存在-10區(qū)和-35區(qū)-10區(qū)：在-6~-13bp之間，共同序列為TATAAT，又稱pribnow框，酶在此處與DNA結(jié)合成穩(wěn)定的復(fù)合物，在轉(zhuǎn)錄方向上解開雙鏈形成開放型起始結(jié)構(gòu)。-35區(qū)：共同序列為TTGACA，是RNA聚合酶起始識(shí)別區(qū)，這一識(shí)別過程與σ因子有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，在原核生物中，絕大部分啟動(dòng)子都有以下共同的結(jié)構(gòu)：在大約位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游10bp處，有一段共同的序列，其堿基組成為TATAAT，是RNA聚合酶緊密結(jié)合的位點(diǎn)，一般稱為-10區(qū)。在大約位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游35bp處，有一段共同的序列，其堿基組成為TTGACA，是RNA聚合酶起始識(shí)別區(qū)，一般稱為-35區(qū)。2.真核啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)在真核生物基因組中，在大約位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游25bp處，有一段共同的序列，其堿基組成為TATAAA，稱為TATA區(qū)，與原核生物的-10區(qū)相對(duì)應(yīng)，是RNA聚合酶緊密結(jié)合的位點(diǎn)。另外，在大約位于轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游75bp處，有一段共同的序列，其堿基組成為CCAAT，稱為CAAT區(qū)，它與原核生物的-35區(qū)相對(duì)應(yīng)，是RNA聚合酶起始識(shí)別區(qū)。3.啟動(dòng)子的識(shí)別（1）大腸桿菌RNA聚合酶全酶RNA聚合酶全酶包括五個(gè)亞基，分別是α、α、β、β＇、σ。σ亞基主要在酶與啟動(dòng)子識(shí)別過程中起作用。但催化RNA合成必須是全酶。（2）RNA聚合酶與啟動(dòng)子的識(shí)別一般認(rèn)為，RNA聚合酶并不與直接識(shí)別堿基對(duì)本身，而是通過氫鍵互補(bǔ)的方式加以識(shí)別。在啟動(dòng)子區(qū)DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中，存在著氫鍵的供體與受體，它們分別處于DNA分子的大溝或小溝內(nèi)，因此具有特定的方位。而酶分子中也有處于特定空間構(gòu)象的氫鍵供體與受體，當(dāng)它們與啟動(dòng)子中對(duì)應(yīng)的分子在一定距離內(nèi)相互補(bǔ)時(shí)，就形成氫鍵，相互結(jié)合。在識(shí)別過程中，主要是RNA聚合酶的σ亞基識(shí)別啟動(dòng)子的-35區(qū)（原核）或-75區(qū)（真核）。4.酶與啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合研究表明，在RNA聚合酶與啟動(dòng)子相互作用的過程中，RNA聚合酶首先與啟動(dòng)子區(qū)閉合雙鏈DNA相結(jié)合，形成二元閉合復(fù)合物，然后經(jīng)過解鏈得到二元開放復(fù)合物。解鏈區(qū)一般在-9~+13之間，而酶與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的主要區(qū)域在其上游。一旦開鏈區(qū)解鏈，酶分子就能以正確的取向與解鏈后的有關(guān)單鏈相互作用，形成開鏈復(fù)合物。因此，RNA聚合酶既是雙鏈DNA結(jié)合蛋白，又是單鏈DNA結(jié)合蛋白。DNA開鏈?zhǔn)前凑誅NA模板序列正確引入核苷酸底物的必要條件。在這一過程中，起催化作用的主要是RNA聚合酶II，而且RNA聚合酶II必須磷酸化。RNA聚合酶II剛與啟動(dòng)子結(jié)合時(shí)并沒有磷酸化，只有當(dāng)DNA解鏈后，RNA聚合酶II與單鏈DNA相結(jié)合，形成開鏈復(fù)合物后，RNA聚合酶II才被磷酸化，從而具有催化RNA合成的功能。5.-10區(qū)和-35區(qū)的距離在原核生物中，-10區(qū)和-35區(qū)相距約16~19bp，大致是雙螺旋繞兩周的長度，兩個(gè)結(jié)合區(qū)在DNA分子的同一側(cè)面。小于15bp或大于20bp都會(huì)降低啟動(dòng)子的活性。保持啟動(dòng)子這二段序列以及它們之間距離是十分重要的，否則就會(huì)改變它所控制基因的表達(dá)水平。6.啟動(dòng)子突變?cè)诩?xì)菌中常見兩種啟動(dòng)子突變，一種叫下降突變，如果把pribnow區(qū)從TATAAT變成AATAAT，就會(huì)大大降低其結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄水平。另一類突變叫上升突變，既增加pribnow區(qū)共同序列的同一性。例如，在乳糖操縱子的啟動(dòng)子中，將其pribnow區(qū)從TATGTT變?yōu)門ATATT，就會(huì)提高啟動(dòng)子的效率，提高乳糖操縱子基因的轉(zhuǎn)錄水平。7.增強(qiáng)子及其功能除了啟動(dòng)子以外，近年來還發(fā)現(xiàn)另一序列與轉(zhuǎn)錄的起始有關(guān)。它不是啟動(dòng)子的一部分，但能增強(qiáng)或促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始，除去這一序列會(huì)大大降低基因的轉(zhuǎn)錄水平。把這一序列稱為增強(qiáng)子。（1）增強(qiáng)子：能使與它連鎖的基因轉(zhuǎn)錄頻率明顯增強(qiáng)的DNA序列，是基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)元件。（2）作用機(jī)制：通過改變模板DNA的整體結(jié)構(gòu)（影響DNA-Pro復(fù)合物的結(jié)構(gòu)或改變DNA超螺旋密度），從而使RNA聚合酶更容易與模板DNA相結(jié)合，起始基因轉(zhuǎn)錄。eg.形成Z-DNA，增強(qiáng)子才有功能。一個(gè)增強(qiáng)子并不限于促進(jìn)某一特殊啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄，它能刺激附近的任一啟動(dòng)子。無論把增強(qiáng)子放在轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)上游或下游，它都有轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)作用。（3）特點(diǎn)：A.遠(yuǎn)距離效應(yīng)B.無方向性C.順式調(diào)節(jié)D.無物種和基因的特異性E.具有組織特異性F.有相位性G.有的增強(qiáng)子可以對(duì)外部信號(hào)產(chǎn)生反應(yīng)(4.)轉(zhuǎn)錄復(fù)合體和增強(qiáng)子8.真核生物啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響真核基因的啟動(dòng)子在-25~-35區(qū)含有TATA序列，稱為TATA區(qū)（TATAbox），在-70~-80區(qū)含有CCAAT序列（CAATbox），在-80~-110含有GCCACACCC或GGGCGGG序列（GCbox）。習(xí)慣上將TATA區(qū)上游的保守序列稱為上游啟動(dòng)子元件（UPE）或上游激活序列（UAS）。（1.）原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)的結(jié)構(gòu)差異比較原核和真核基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游區(qū)的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)兩者之間存在很大差別，主要表現(xiàn)在以下方面：A.原核基因啟動(dòng)區(qū)范圍較小，TATAAT的中心位于-7~-10，上游-30~-70為正調(diào)控因子結(jié)合序列，+1~-20為負(fù)調(diào)控因子結(jié)合序列；真核基因的調(diào)控較大，TATAAT的位于-20~-30，-40~-110區(qū)為上游激活區(qū)。B.大多數(shù)原核基因啟動(dòng)子上游只有TTGACA作為RNA聚合酶的主要結(jié)合位點(diǎn)，參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控；真核基因除了CAAT外，大多數(shù)還有GC區(qū)和增強(qiáng)子區(qū)。（2）啟動(dòng)子區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響TATA區(qū)和其它兩個(gè)UPE區(qū)的作用有所不同。前者的主要作用是使轉(zhuǎn)錄精確地起始，如果除去TATA區(qū)或進(jìn)行堿基突變，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物下降的相對(duì)值不如CAAT區(qū)或GC區(qū)突變后明顯，但發(fā)現(xiàn)所獲得的RNA產(chǎn)物起始不固定。研究SV40（猿猴病毒40）晚期基因啟動(dòng)子發(fā)現(xiàn)，上游激活區(qū)的存在與否，對(duì)該啟動(dòng)子的生物活性有著根本性影響。若將該基因5′上游-21~-47核苷酸序列切除，該基因完全不表達(dá)。CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。CAAT區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響基因的靶轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度，而啟動(dòng)區(qū)其他序列中一二個(gè)堿基的置換則沒有太大的影響。此外，在CAAT區(qū)和相鄰的兩個(gè)UPE區(qū)之間插入核苷酸也會(huì)使轉(zhuǎn)錄減弱。例如，在人類β-血紅蛋白基因啟動(dòng)區(qū)的兩個(gè)UPE區(qū)之間插入15個(gè)核苷酸，該啟動(dòng)子完全失去功能。所以，啟動(dòng)子區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響歸納起來有以下幾點(diǎn)：A．TATA區(qū)主要是使轉(zhuǎn)錄精確的起始。B．CAAT區(qū)和GC區(qū)主要控制轉(zhuǎn)錄起始的頻率，基本不參與起始位點(diǎn)的確定。C．CAAT區(qū)對(duì)轉(zhuǎn)錄起始頻率的影響最大，該區(qū)任一堿基的改變都將極大地影響基因的靶轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度。D．在CAAT區(qū)和相鄰的兩個(gè)UPE區(qū)之間插入核苷酸也會(huì)使轉(zhuǎn)錄減弱。第六節(jié)原核生物和真核生物mRNA的特征比較雖然mRNA在所有細(xì)胞內(nèi)執(zhí)行著相同的功能，即通過密碼三聯(lián)子翻譯生成蛋白質(zhì)，但其生物合成的具體過程和成熟mRNA結(jié)構(gòu)在原核和真核細(xì)胞內(nèi)是不同的。真核細(xì)胞mRNA的最大特點(diǎn)在于它往往以一個(gè)較大相對(duì)分子質(zhì)量的前體RNA出現(xiàn)在核內(nèi)，只有成熟的、相對(duì)分子質(zhì)量明顯變小并經(jīng)過化學(xué)修飾的mRNA才能進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成。所以，真核細(xì)胞mRNA的合成和功能表達(dá)發(fā)生在不同的空間和時(shí)間范疇內(nèi)。在原核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯不僅發(fā)生在同一個(gè)細(xì)胞空間里，而且這兩個(gè)過程幾乎是同步進(jìn)行的，蛋白質(zhì)的合成往往在mRNA剛開始轉(zhuǎn)錄就被引發(fā)。一個(gè)原核生物的mRNA有時(shí)可以編碼幾個(gè)多肽，而一個(gè)真核生物的mRNA只能編碼一個(gè)多肽。原核生物常以AUG（有時(shí)GUG，甚至UUG）作為起始密碼子，而真核生物幾乎永遠(yuǎn)以AUG作為起始密碼子。一.原核生物mRNA的特征1.原核生物mRNA的半衰期短細(xì)菌基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯是緊密相聯(lián)的，基因轉(zhuǎn)錄一旦開始，核糖體就結(jié)合到新生的mRNA鏈的5′端，啟動(dòng)蛋白質(zhì)合成，而此時(shí)該mRNA的3′端還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有轉(zhuǎn)錄完。絕大多數(shù)細(xì)菌mRNA的半衰期短短得驚人，mRNA的降解緊隨著翻譯過程發(fā)生?，F(xiàn)在一般認(rèn)為，轉(zhuǎn)錄開始1分鐘之后，降解就開始了。也就是說，當(dāng)一個(gè)mRNA的5′端開始降解時(shí)，其3′端部分可能仍在合成或翻譯。但mRNA降解的速度比轉(zhuǎn)錄或翻譯的速度慢，大約只有轉(zhuǎn)錄或翻譯的速度的一半。因?yàn)榛蜣D(zhuǎn)錄和多肽鏈延伸的速度基本相同，所以細(xì)胞內(nèi)某一基因產(chǎn)物的多少?zèng)Q定于轉(zhuǎn)錄和翻譯的起始效率。在細(xì)胞中，新生mRNA與成熟mRNA受核酶攻擊的概率是相等的。所以，有些mRNA可能被翻譯很多次，而同一群體中的另一些mRNA可能根本沒有被翻譯。雖然mRNA的命運(yùn)是隨機(jī)的，但某一mRNA的產(chǎn)物卻是大致穩(wěn)定的。2.許多原核生物mRNA以多順反子的形式存在細(xì)菌mRNA可以同時(shí)編碼不同的蛋白質(zhì)，我們把只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為單順反子，把編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA稱為多順反子。多順反子是一組相鄰或相互重疊基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。單順反子：只編碼一個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。多順反子：編碼多個(gè)蛋白質(zhì)的mRNA。是一組相鄰或相互重疊基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。所有mRNA都包括：編碼區(qū)、位于AUG之前的5′端上游非編碼區(qū)、位于終止密碼子后不翻譯的3′端下游非編碼區(qū)。編碼區(qū)從起始密碼子AUG開始，經(jīng)一連串編碼氨基酸的密碼子直到終止密碼子。對(duì)于第一個(gè)密碼子來說，一旦mRNA的5′端被合成，翻譯起始點(diǎn)即可與核糖體相結(jié)合，而后面幾個(gè)順反子翻譯的起始就會(huì)受其上游順反子結(jié)構(gòu)的調(diào)控。多順反子翻譯存在兩種情況：一種情況是，當(dāng)兩個(gè)順反子之間距離較遠(yuǎn)時(shí)，第一個(gè)蛋白質(zhì)合成終止以后，核糖體分解成大、小亞基，脫離mRNA模板。第二個(gè)蛋白的翻譯必須等到新的小亞基和大亞基與該蛋白起始密碼子相結(jié)合后才可能開始（圖3-12a）。另一中情況是，當(dāng)兩個(gè)順反子之間距離較近時(shí)，前一個(gè)多肽翻譯完成以后，核糖體大、小亞基分離，但小亞基不離開mRNA模板，而是迅速與游離的大亞基結(jié)合，啟動(dòng)第二個(gè)多肽的合成（圖3-12b）。在多順反子中，后面幾個(gè)順反子翻譯的起始受其上游順反子的調(diào)控。在噬菌體RNA中，一個(gè)順反子的翻譯有時(shí)完全取決于它前面順反子的翻譯，因?yàn)槭删wRNA往往形成復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，只要第一個(gè)翻譯起始位點(diǎn)是暴露的，在這個(gè)順反子翻譯產(chǎn)生多肽的過程中，核糖體的運(yùn)動(dòng)破壞了后續(xù)順反子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使起始位點(diǎn)較容易與核糖體相結(jié)合形成起始復(fù)合物。（圖3-12）。3.原核生物mRNA的5′端無帽子結(jié)構(gòu)，3′端沒有或只有較短的poly（A）原核生物起始密碼子AUG上游7-12個(gè)核苷酸處有一個(gè)被稱為SD序列的保守區(qū)。SD序列：位于原核生物起始密碼子AUG上游處約7-12個(gè)核苷酸的保守序列。二.真核生物mRNA的特征凡是編碼功能蛋白的真核基因都通過RNA聚合酶II進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，真核基因幾乎都是單順反子，只包含一個(gè)蛋白質(zhì)的信息，其長度在幾百到幾千個(gè)核苷酸之間。一個(gè)完整的基因，不但包括編碼區(qū)，還包括5′和3′端長度不等的特異性序列，它們雖然不編碼氨基酸，卻在基因表達(dá)的過程中起著重要作用。真核生物mRNA在結(jié)構(gòu)上的最大特征是5′端的帽子和3′端的poly（A）結(jié)構(gòu)。1.真核生物mRNA的5′端存在帽子結(jié)構(gòu)真核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄一般從嘌呤（A或G）起始。但成熟的mRNA的5′端是以5′—5′三磷酸基團(tuán)相連的二核苷酸，5′端是一個(gè)在mRNA轉(zhuǎn)錄后加上去的甲基化的鳥嘌呤。（圖3-15）（1）mRNA5′端加“G”的反應(yīng)是由鳥苷酸轉(zhuǎn)移酶完成的。在新生的mRNA鏈達(dá)到50個(gè)核苷酸之前，甚至可能在RNA聚合酶II離開轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)之前，帽子結(jié)構(gòu)就已經(jīng)加到mRNA的第一個(gè)核苷酸上了。或者說，mRNA幾乎一誕生就是戴上帽子的。一般認(rèn)為，帽子結(jié)構(gòu)是GTP和原mRNA5′三磷酸腺苷縮合反應(yīng)的產(chǎn)物，新加上的G與mRNA連上所有其他核苷酸方向正好相反，像一頂帽子倒扣在mRNA鏈上。（2）mRNA的帽子結(jié)構(gòu)常常被甲基化。第一個(gè)甲基出現(xiàn)在所有真核細(xì)胞的mRNA中，由鳥苷酸-7-甲基轉(zhuǎn)移酶催化，稱為0號(hào)帽子。帽子結(jié)構(gòu)的第二步是在第二個(gè)核苷酸（原mRNA5′的第一位）的2′-OH上加一個(gè)甲基，這步反應(yīng)由2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶催化。稱為1號(hào)帽子。真核生物中以這類帽子為主。當(dāng)mRNA原第二位核苷酸是腺嘌呤時(shí)，其N6位有時(shí)也被甲基化，這一反應(yīng)只能在2′-OH被甲基化以后才能發(fā)生。在某些生物細(xì)胞內(nèi)，mRNA上的第三個(gè)核苷酸的2′-OH也可能被甲基化，這個(gè)反應(yīng)只以帶有1號(hào)帽子的mRNA為底物，稱為2號(hào)帽子。有2號(hào)帽子的mRNA只占有有帽mRNA總量的10-15%以下。（3）帽子結(jié)構(gòu)可能使mRNA免遭核酸酶的破壞。例如，去除珠蛋白mRNA5′端的7-甲基鳥嘌呤后，該mRNA分子的翻譯活性和穩(wěn)定性都明顯下降。而且，有帽子結(jié)構(gòu)的mRNA更容易被蛋白質(zhì)合成的起始因子所識(shí)別，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成。用化學(xué)方法除去5′端的甲基后，mRNA作為蛋白質(zhì)合成模板的活性消失，說明mRNA5′端甲基化的帽子是翻譯所必須的。2.真核生物mRNA5′端帽子結(jié)構(gòu)的功能保護(hù)mRNA免受5’-核酸外切酶降解；使mRNA進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；對(duì)翻譯起識(shí)別作用（m7G5’ppp5’Np優(yōu)先與核糖體結(jié)合）。3.絕大多數(shù)真核生物mRNA具有poly（A）尾巴（1）真核生物mRNA的加尾反應(yīng)除組蛋白基因外，大多數(shù)真核生物mRNA3′末端都有poly（A）序列，其長度隨mRNA的種類不同而變化，一般為40-200個(gè)，poly（A）序列可能在細(xì)胞核中加上去的。目前還不清楚RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄基因的精確終止位點(diǎn)，但幾乎所有真核基因的3′末端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)上游15-30bp處的保守序列AAUAAA對(duì)于初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的準(zhǔn)確切割及加poly（A）是必需的。盡管poly（A）位點(diǎn)及AATAAA的存在對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄和成熟意義重大，但RNA聚合酶II卻不在poly（A）位點(diǎn)終止而是繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，大部分已知基因的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物擁有poly（A）位點(diǎn)下游0.5-2kb核苷酸序列。加poly（A）時(shí)需要內(nèi)切酶切開mRNA3′末端的特定部位，然后由多聚腺苷酸合成酶催化多聚腺苷酸反應(yīng)。AATAAA的存在對(duì)于基因的轉(zhuǎn)錄和成熟意義重大，如果將AATAAA保守序列切除，該基因組合的轉(zhuǎn)錄活性消失。點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)將AAUAAA變?yōu)锳AGAAA，雖然維持了該基因的轉(zhuǎn)錄活性，卻發(fā)現(xiàn)mRNA的剪接加工受阻，因而沒有功能性mRNA產(chǎn)生。（2）poly（A）尾巴的功能poly（A）是mRNA由細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)所必需的形式，它大大提高了mRNA在細(xì)胞質(zhì)中的穩(wěn)定性，防止mRNA受核酶的攻擊而降解。當(dāng)mRNA剛從細(xì)胞核進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)時(shí)，其poly（A）尾巴一般較長，隨著mRNA在細(xì)胞質(zhì)中逗留時(shí)間延長，poly（A）尾巴逐漸變短消失，mRNA進(jìn)入降解過程。第四節(jié)終止和抗終止到目前為止，科學(xué)家還沒有發(fā)現(xiàn)某個(gè)單一位點(diǎn)具有特異的轉(zhuǎn)錄終止功能。但是小鼠β-珠蛋白基因的終止區(qū)能被用來終止腺病毒基因的轉(zhuǎn)錄，膿桿菌胭脂堿合成酶基因的終止區(qū)能被用來終止幾乎所有的外源基因，說明可能存在共同的轉(zhuǎn)錄終止機(jī)制。一般情況下，RNA聚合酶起始基因轉(zhuǎn)錄后，它就會(huì)沿著摸板5＇——3＇方向不停地移動(dòng)，合成RNA鏈，直到碰上終止信號(hào)時(shí)才與摸板DNA相脫離并釋放新生RNA鏈。終止發(fā)生時(shí)，所有參與形成RNA-DNA雜合體的氫鍵都必須被破壞，摸板DNA鏈才能與有意義鏈重新組合成DNA雙鏈。一、不需要ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止——強(qiáng)終止子摸板DNA鏈上存在轉(zhuǎn)錄終止的特殊信號(hào)——終止子，每個(gè)基因或操縱子都有一個(gè)啟動(dòng)子和終止子。終止位點(diǎn)上游一般存在一個(gè)富含GC堿基的二重對(duì)稱區(qū)，由這段DNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA容易形成發(fā)卡式結(jié)構(gòu)。在終止位點(diǎn)前面有一段4-8個(gè)A組成的序列，所以轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3＇端為寡聚U，這種特征的存在決定轉(zhuǎn)錄的終止。在新生RNA鏈中出現(xiàn)發(fā)卡式結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致RNA聚合酶的暫停，破壞RNA-DNA雜合鏈5＇端的正常結(jié)構(gòu)。寡聚U的存在使雜合鏈3＇端部分出現(xiàn)不穩(wěn)定的U-A區(qū)域。兩者的共同作用使RNA從三元復(fù)合物中解離出來。終止效率與二重對(duì)稱序列和寡聚U的長短有關(guān)，隨著發(fā)卡式結(jié)構(gòu)和寡聚U序列長度的增加，終止效率逐步提高。特點(diǎn)：DNA序列有雙重對(duì)稱，形成末端發(fā)夾結(jié)構(gòu)，模板DNA上有一串A，RNA3’端有UUUU，使新合成的RNA脫落。二、需要ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止1.正常終止體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)表明，純化的RNA聚合酶并不能識(shí)別特異性的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，而加入大腸桿菌ρ因子后該聚合酶就能在DNA模板上準(zhǔn)確地終止轉(zhuǎn)錄。ρ因子是一個(gè)相對(duì)分子質(zhì)量為2x105的六聚體蛋白，能水解各種核苷三磷酸，實(shí)際上是一種NTP酶，它能催化NTP的水解促使新生RNA鏈從三元復(fù)合物中解離出來，從而終止轉(zhuǎn)錄。依賴于ρ因子的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)DNA序列缺乏共性，說明該因子并不能識(shí)別終止位點(diǎn)。現(xiàn)在一般認(rèn)為，RNA合成起始后，ρ因子即附著在新生的RNA鏈上，靠ATP水解的能量，沿著5＇——3＇方向朝RNA聚合酶移動(dòng)，到達(dá)RNA的3＇-OH端后取代暫停在終止位點(diǎn)上的RNA聚合酶，使之從摸板DNA上釋放mRNA，完成轉(zhuǎn)錄過程。終止子后無連續(xù)的A，在ρ因子作用下，ATP酶水解，釋放能量，使新生RNA與模板脫落。2.提前終止無意義突變時(shí)，ρ因子可能使轉(zhuǎn)錄提前終止。RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA后，核糖體結(jié)合到mRNA上。核糖體在突變位點(diǎn)時(shí)由于不能編碼蛋白質(zhì)而解離。ρ因子追上RNA聚合酶使轉(zhuǎn)錄提前終止。三、抗終止由于不同的生理要求，在轉(zhuǎn)錄過程中，有時(shí)即使遇到終止信號(hào)，仍需要繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，于是出現(xiàn)了抗終止現(xiàn)象?？罐D(zhuǎn)錄終止主要兩種方式：（1）破壞終止位點(diǎn)RNA的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)在一些控制氨基酸合成的操縱子結(jié)構(gòu)基因前面有一段前導(dǎo)序列，具有終止信號(hào)，之間有串聯(lián)的編碼某一種氨基酸的密碼子，由于轉(zhuǎn)錄與翻譯是偶聯(lián)的，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA形成后立即通過核糖體指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成，當(dāng)介質(zhì)中該氨基酸濃度較高時(shí)，與此相對(duì)應(yīng)的氨?；鵷RNA含量也高，因此，核糖體能順利通過串聯(lián)密碼子。在這種情況下，mRNA形成正常的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其中包括末端的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，RNA聚合酶終止轉(zhuǎn)錄。當(dāng)介質(zhì)中該氨基酸濃度較低時(shí)，缺乏相應(yīng)的氨?；鵷RNA，致使核糖體滯留在串聯(lián)密碼子上，mRNA不能形成正常的二級(jí)結(jié)構(gòu)，末端的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，因此轉(zhuǎn)錄仍能繼續(xù)進(jìn)行下去，出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄的抗終止現(xiàn)象。（2.）依賴于蛋白質(zhì)因子的轉(zhuǎn)錄抗終止λ噬菌體中由N基因編碼產(chǎn)生的N蛋白具有抗轉(zhuǎn)錄終止作用，但其功能的發(fā)揮依賴于寄主所產(chǎn)生的NusA、NusB、S10和2.5x104等幾種蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)結(jié)合到終止子附近的DNA位點(diǎn)上是實(shí)現(xiàn)抗轉(zhuǎn)錄終止的必要條件。該DNA位點(diǎn)中含有A區(qū)（CGCTCTTA）和一個(gè)二重對(duì)稱序列，N蛋白能識(shí)別后者轉(zhuǎn)錄所形成的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)并與之結(jié)合。NusA以二聚體的形式存在，其一個(gè)亞基與RNA聚合酶結(jié)合，另一個(gè)亞基與N蛋白結(jié)合，當(dāng)其他三種蛋白都結(jié)合到Nut位點(diǎn)時(shí)，便形成一個(gè)蛋白復(fù)合物，并通過NusA與RNA聚合酶相結(jié)合，改變聚合酶的構(gòu)像，使之對(duì)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)不敏感，繼續(xù)催化RNA鏈的合成。第七節(jié)真核生物RNA的轉(zhuǎn)錄后加工一.真核生物RNA中的內(nèi)含子真核基因大多是斷裂的，也就是說，一個(gè)基因可以由多個(gè)內(nèi)含子和外顯子間隔排列而成。1.外顯子extron：成熟的mRNA或蛋白質(zhì)中存在的序列。（在DNA或成熟mRNA中都存在的序列）2.內(nèi)含子intron：在DNA上存在，而在mRNA（或cDNA）中不存在的序列，初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工成成熟mRNA時(shí)被切除的間隔序列。3.RNA中的內(nèi)含子的證據(jù)用成熟mRNA與帶有該基因的互補(bǔ)鏈DNA序列雜交，證明雞卵清蛋白基因中存在非編碼的內(nèi)含子區(qū)。二、真核生物tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工1、tRNA內(nèi)含子的特點(diǎn)（1）長度和序列沒有共同性，一般有16-46個(gè)核苷酸（2）位于反密碼子的下游（3）內(nèi)含子和外顯子的邊界沒有保守序列2、tRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工（1）內(nèi)含子的剪接tRNA核酸內(nèi)切酶切割前體分子中的內(nèi)含子，RNA連接酶將外顯子部分連接在一起。（2）3′端添加CCA真核生物所有tRNA前體的3′端缺乏-CCA-OH結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)翻譯過程中沒有活性，因而需要在tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶的催化下在其3′端添加CCA。（3）核苷酸修飾tRNA分子中稀有核苷酸較多，修飾很頻繁。三、真核生物rRNA前體的轉(zhuǎn)錄后加工（1）在5′端切除非編碼的序列，生成41S的中間產(chǎn)物。（2）41SRNA再被切割成兩段，一段為32S，含有28SrRNA和5.8SrRNA，另一段為20S，含有18SrRNA。（3）32SRNA進(jìn)一步被剪切成28SrRNA和5.8SrRNA。（4）20SRNA被剪切成18SrRNA。四、真核生物mRNA的剪接1、RNA序列決定了剪接的發(fā)生位點(diǎn)多數(shù)細(xì)胞mRNA前體內(nèi)含子的5′端邊界序列為GU，3′端邊界序列為AG。次要（AU---AC）。2、RNA剪接中的兩步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)（II類內(nèi)含子?線粒體和葉綠體?）第一步轉(zhuǎn)酯反應(yīng)是由位于分支位點(diǎn)的保守腺苷酸的2′-OH引發(fā)的。它作為親核基團(tuán)攻擊5′剪接位點(diǎn)保守鳥苷酸的磷酰基團(tuán)。結(jié)果，外顯子3′端的核糖與內(nèi)含子5′端的磷酸二酯鍵被斷開，游離出來的5′磷酸基團(tuán)則與分支位點(diǎn)的保守腺苷酸的2′-OH鏈接。因此，除5′→3′骨架磷酸二酯鍵，新的磷酸二酯鍵從保守腺苷酸的2′-OH伸出來，產(chǎn)生一個(gè)三叉交匯點(diǎn)。第二轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中，5′外顯子作為親核基團(tuán)，攻擊3′剪接位點(diǎn)的磷酰基團(tuán)，導(dǎo)致兩個(gè)結(jié)果：一是把5′和3′外顯子連接起來，二是把內(nèi)含子作為離去基團(tuán)釋放出去。因?yàn)閮?nèi)含子的5′端已經(jīng)在第一次的轉(zhuǎn)酯反應(yīng)中與分支位點(diǎn)的腺苷酸相連接，所有釋放出來的內(nèi)含子形狀像個(gè)套索（lariatform）。3、RNA剪接大多發(fā)生在剪接體上（pre-mRNA）（主要剪接方式）(1)參與剪接的小分子物質(zhì)核內(nèi)RNA（如U1，U2，U4，U5和U6）以及與這些RNA相結(jié)合的核蛋白（snRNPs）。(2)剪接過程許多相對(duì)分子質(zhì)量較小的核內(nèi)RNA（如U1，U2，U4，U5和U6）以及與這些RNA相結(jié)合的核蛋白（snRNPs）參與RNA的剪接。mRNA鏈上每個(gè)內(nèi)含子的5＇端和3＇端分別與不同的snRNP相結(jié)合，形成RNA和RNP復(fù)合物