蛋白質(zhì)含量測(cè)定蔗糖酶活力測(cè)定及純化方案的評(píng)價(jià)

專業(yè)：園藝姓名：尚靜專業(yè)：園藝姓名：尚靜學(xué)號(hào)：3140100506日期：2015年10月26日地點(diǎn)：生物實(shí)驗(yàn)中心裝訂線課程名稱：生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)（甲）指導(dǎo)老師：方祥年成績(jī)：__________________實(shí)驗(yàn)名稱：蛋白質(zhì)含量測(cè)定、蔗糖酶活力測(cè)定及純化方案的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)類型：同組學(xué)生姓名：沈杭寧、董文婷、蔣天佑一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵螅ū靥睿? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理（必填）三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑（必填）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（必填） 五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟（必填）六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理 七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析（必填）八、討論、心得一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量的原理和方法2、掌握分光光度法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確測(cè)定未知樣品的蛋白質(zhì)含量3、掌握分光光度計(jì)的使用方法4、掌握酶活力測(cè)定的基本原理和方法5、學(xué)習(xí)酶的比活力的計(jì)算二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1.Folin-酚法測(cè)定蛋白質(zhì)含量Folin-酚測(cè)定法是在雙縮脲反應(yīng)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的，F(xiàn)olin-酚試劑是由甲、乙兩種試劑組成的。甲試劑由碳酸鈉、氫氧化鈉、硫酸銅和酒石酸鉀鈉組成，在堿性條件下蛋白質(zhì)中的肽鍵與酒石酸鉀鈉銅鹽起作用，生成紫紅色絡(luò)合物；乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸、硫酸、溴等組成，在堿性條件下，銅-蛋白質(zhì)絡(luò)合物以及蛋白質(zhì)中的酪氨酸殘基（酚基）和色氨酸還原磷鉬酸-磷鎢酸試劑（乙試劑）產(chǎn)生深藍(lán)色（鉬藍(lán)和鎢藍(lán)的混合物），其色澤深淺與蛋白質(zhì)含量成正比?？捎?00nm波長(zhǎng)比色測(cè)定，適于測(cè)定蛋白質(zhì)含量0.05～0.5g/L.2、3,5-二硝基水楊酸比色法蔗糖酶（β-D-呋喃型果糖苷-果糖水解酶EC3.2.1.26），是一種水解酶。它能催化非還原性雙糖（蔗糖）的1,2－糖苷鍵裂解，將蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。因此，每水解1mol蔗糖，就能生成2mol還原糖。還原糖的測(cè)定有多種方法，例如：納爾遜－索模吉（Nelson-Smogyi）試劑比色法，斐林試劑法等。本實(shí)驗(yàn)采用3.5－二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量。其原理是3.5－二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。因此可利用分光光度計(jì)在520nm進(jìn)行比色測(cè)定，求得樣品中的含糖量。蔗糖酶活力單位(u)：蔗糖酶在室溫(25℃）,pH4.5的條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需的酶量(ml)。蔗糖酶比活力的計(jì)算：酶的比活力——為每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力單位數(shù)，一般用酶活力單位/mg蛋白質(zhì)表示（比活力＝活力單位/mg蛋白）。酶的比活力在酶學(xué)研究中用來衡量酶的純度，對(duì)于同一種酶來說，比活力越大，酶的純度越高。利用比活力的大小可以用來比較酶制劑中單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力，是表示酶的純度高低的一個(gè)重要指標(biāo)。注：*葡萄糖（分子量：180.1572）和果糖（分子量：180.16）為同分異構(gòu)體。三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑1、實(shí)驗(yàn)材料蔗糖酶提取的各步分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ?？筛鶕?jù)樣品溶液的蛋白質(zhì)含量高低作適當(dāng)?shù)南♂尅?、實(shí)驗(yàn)試劑(1)Folin-酚測(cè)定法： ①標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：0.5g/L牛血清白蛋白 ②Folin-酚試劑（甲試劑、乙試劑）(2)3,5-二硝基水楊酸比色法： ①1g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(葡萄糖相對(duì)分子量198.17） ②5％蔗糖溶液 ③0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5 ④3,5－二硝基水楊酸試劑（DNS）四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器（1）恒溫水?。?0℃、100℃）（2）可見光分光光度計(jì)、1cm玻璃比色皿（3）試管、試管架（4）移液管（5）微量移液器：200μl、1000μl五、操作方法和實(shí)驗(yàn)步驟1.Folin-酚測(cè)定法：（1）制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線取6支試管，編號(hào)1－6，按表1順序依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測(cè)定光吸收值（A500nm值）。（2）各步分離純化的蔗糖酶蛋白測(cè)定由于蔗糖酶提取、分離純化的各個(gè)樣品的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量較高，因此在測(cè)蔗糖酶提取分離純化樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量以前，可根據(jù)各樣品溶液的蔗糖酶蛋白質(zhì)含量高低不同作適當(dāng)?shù)南♂?，以測(cè)定蔗糖酶蛋白質(zhì)含量A500nm值在蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍以內(nèi)為宜。取13支試管，編號(hào)1～13，按表2依次加入各種試劑，并在分光光度計(jì)于500nm處測(cè)定光吸收值（A500nm值）。（3）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以光吸收值（A500nm）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量（mg/L）為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算：蔗糖酶提取分離純化的樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ稀釋溶液的光吸收值（A500nm），查蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶蛋白含量，再進(jìn)行樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最終蔗糖酶蛋白含量的計(jì)算。2.3,5-二硝基水楊酸比色法：（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作表31234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.51g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（ml）00.20.30.40.50.60.7H2O（ml）21.81.71.61.51.41.33.5－二硝基水楊酸(ml)1.01.01.01.01.01.01.0將各管溶液混勻后，在100℃恒溫水浴加熱5min，取出立即用冷水冷卻至室溫蒸餾水（ml）7777777將各管溶液混勻A520nm按照表3加樣，以葡萄糖含量（umol）為橫坐標(biāo)，A520值為縱坐標(biāo)，制作葡萄糖濃度－吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）蔗糖酶的酶活力測(cè)定表4樣品空白I(200倍稀釋)Ⅱ(200倍稀釋)Ⅲ(200倍稀釋)Ⅳ(100倍稀釋)編號(hào)123456789101112130.2mol/L乙酸緩沖液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5蒸餾水(ml)1.00.950.80.50.950.80.50.950.80.50.950.80.5蔗糖酶液(ml)0.00.050.20.50.050.20.50.050.20.50.050.20.55％蔗糖溶液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保溫時(shí)間立即混勻后，50℃保溫10min3.5－二硝基水楊酸試劑(ml)1111111111111在100℃恒溫水浴中加熱5min蒸餾水7777777777777混勻A520根據(jù)測(cè)得的光吸收值（A520），查標(biāo)準(zhǔn)曲線得蔗糖酶活力，再進(jìn)行樣品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ溶液的最終蔗糖酶活力的計(jì)算。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理1.Folin-酚測(cè)定法：制備Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線表5Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)記錄試管號(hào)123456A500nm00.1650.2700.4190.5130.639Folin-酚法蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線（2）各步分離純化的樣品蛋白含量測(cè)定表6各步分離純化的蔗糖酶蛋白測(cè)定樣品空白I(1:20稀釋)Ⅱ(1:10稀釋)Ⅲ(1:5稀釋)Ⅳ(1:1稀釋)編號(hào)12345678910111213A500nm00.1100.2740.6240.2650.4280.9130.1820.6661.0390.3010.7631.492蔗糖酶蛋白含量（mg）00.07110.20190.48110.19470.32470.71160.12850.5146—0.22340.5919—每ml稀釋液蛋白含量(mg)01.42201.00950.96223.89401.62351.42322.57002.5730—4.46802.9595—每ml稀釋液蛋白含量平均值(mg)01.13102.31362.57153.71382.3,5-二硝基水楊酸比色法：（1）制備3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線表73,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)記錄試管號(hào)1234567葡萄糖含量(umol)01.01.52.02.53.03.5A520nm00.2450.3990.5180.8771.095數(shù)值過大舍去3,5-二硝基水楊酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線蔗糖酶的酶活力測(cè)定表8蔗糖酶酶活力測(cè)定數(shù)據(jù)記錄樣品空白I(200倍稀釋)Ⅱ(200倍稀釋)Ⅲ(200倍稀釋)Ⅳ(100倍稀釋)編號(hào)12345678910111213A520nm00.3181.4951.6680.2361.3391.6840.3761.5621.7300.6431.7091.793葡萄糖含量（umol）01.1080——0.8838——1.2665——1.9964——蔗糖酶活力單位(u)00.1108——0.0884——0.1267——0.1996——稀釋液中蔗糖酶活力(u/ml)02.216——1.768——2.534——3.992——稀釋液中蔗糖酶活力平均值(u/ml)02.2161.7682.5343.992七、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析結(jié)果：表9蔗糖酶各步純化樣品的純度與酶活力比較體積(ml)蛋白濃度(mg/ml)總蛋白(mg)活力(u/ml)總活力u比活力u/mg樣品Ⅰ20.022.620452.400443.28864.019.6樣品Ⅱ16.523.136381.744353.65834.415.3樣品Ⅲ9.512.858122.151506.84814.639.4樣品Ⅳ16.13.713859.792399.26427.12107.5分析：由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可得，隨著逐漸的分離提純，樣品Ⅰ到樣品Ⅳ的蛋白濃度降低，總蛋白含量也在降低，總活力也有所降低，而比活力則在逐步提高，表明蔗糖酶濃度在逐步提高，基本達(dá)到將蔗糖酶粗提純的目的。樣品Ⅱ的數(shù)據(jù)不是很符合上述結(jié)論，猜測(cè)與以下因素有關(guān)：每次實(shí)驗(yàn)間隔時(shí)間較長(zhǎng)，酶活性及蛋白質(zhì)有所損失，致使樣品Ⅱ的數(shù)據(jù)存在問題。樣品Ⅳ的比活力較高，表明蔗糖酶純度較高，可能與做離子分析柱層析分離純化蔗糖酶這一步時(shí)，裝得的層析