第六章 體外分析課件

第六章體外分析1第六章體外分析定義體外分析以放射性核素或其他非放射性物質標記的配體(Ligand)為示蹤劑，以配體和結合體的結合反應為基礎，在試管內進行的微量生物活性物質的檢測技術。2第六章體外分析放射分析方法或其派生的相關技術在體外進行機體內物質種類和含量的分析測定。測定對象是患者血清或其他體液樣品內的激素、其它生物活性物質和藥物濃度等。3第六章體外分析體外放射分析技術是結合了放射性核素的高靈敏度和特異性結合反應的高特異性的一種超微量分析技術，具有靈敏度高、特異性強、精密度好、樣品用量少、放射線不引入人體內、應用面廣、方法簡便等優(yōu)點。是對多種疾病診治和研究的重要方法之一。1959年由美國Berson&Yalow建立了本方法，Yalow為此在1977年獲得諾貝爾醫(yī)學與生理學獎

4第六章體外分析體外分析技術建立的基礎:以配體和結合體的特異性結合反應為共同的生物學基礎以結合反應動力學規(guī)律作為共同的方法學基礎以放射性等的測量技術作為共同的定量手段5第六章體外分析生物學基礎：特異性結合反應配體-結合體抗原-抗體的免疫結合反應；配基-受體的結合反應；底物-催化酶之間的酶促反應；激素-激素結合球蛋白的結合反應6第六章體外分析方法學基礎：結合反應動力學規(guī)律遵守可逆反應的質量作用定律：k1,v1[L]+[R]

[RL]k2,v27第六章體外分析定量手段

(標記配體作為示蹤劑)放射性測量技術酶定量技術化學發(fā)光定量技術熒光定量技術8第六章體外分析體外分析技術體外放射分析體外非放射分析放射性競爭結合分析放射性非競爭結合分析放射免疫分析

(radioimmunoassay,

RIA)免疫放射分析酶免疫分析化學發(fā)光免疫分析熒光免疫分析(immunoradiometricassay,

IRMA)(EIA)(CLIA)(FIA)分類:9第六章體外分析放射免疫分析

radioimmunoassay,RIA10第六章體外分析放射免疫分析法是Yalow和Berson于1959年在研究胰島素的時候創(chuàng)立的一種體外放射分析技術。結合了放射性核素的高靈敏度和抗原抗體反應的高特異性。Dr.Yalow11第六章體外分析一、RIA的基本原理（一）競爭抑制結合反應：

放射免疫分析是在體外條件下，由足量的非標記抗原（Ag）與定量的標記抗原（*Ag）對限量的特異性抗體（Ab）的競爭抑制結合反應。Ag和*AgAb間呈負相關函數(shù)關系12第六章體外分析基本原理

Ag-Ab+Ag*Ag

AbAg++*Ag-Ab+

*Ag(B)(F)*Ag與Ag

免疫活性相同*Ag＋Ag>

AbAg=*Ag,AgAb=*AgAbAg>*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)Ag<*Ag,*AgAb(B)*Ag(F)13第六章體外分析Ag*AgAb*AgAbAgAb*Ag+++++++++++++++++++++Ag14第六章體外分析（二）劑量反應曲線：標準曲線標記物與被測物之間的函數(shù)關系可以用劑量反應曲線來表示。劑量反應曲線是用一系列標準抗原反應而繪制出來的，所以又叫標準曲線。標準抗原(標準品)是廠家在試劑盒中提供的已知劑量的非標記抗原。15第六章體外分析標準曲線的繪制方法用一系列已知濃度的標準抗原和一定量的標記抗原在一定條件下同限量的特異性抗體進行反應；在反應達到平衡后，利用適當?shù)姆蛛x方法分離B和F；分別測量B和F的放射性；用反應變量（如B/F）作為縱坐標，反應劑量作為橫坐標（即一系列標準抗原）作一條曲線，就得到不同濃度的標準抗原對反應變量的競爭抑制曲線，這就是劑量反應曲線。16第六章體外分析Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB%=B/(B+F)F%=F/(B+F)R=B/FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456濃度17第六章體外分析B%標準曲線18第六章體外分析未知樣品的測量在同等條件下，用待測抗原與一定量的標記抗原與限量特異性抗體發(fā)生反應，并用同樣的方法分離待測抗原的B和F，測量其放射性，計算出B/F，在劑量反應曲線上就可以查出對應的抗原濃度。19第六章體外分析Ag2550100200400800*AgAb分離B、FB1%B2%B3%B4%B5%B6%123456B%？20第六章體外分析B%F%B/FCalibrationCurve6021第六章體外分析在實際的操作中，一般要設立：最大結合管（Bo）：標準抗原的量為0，只有標記抗原和特異性抗體時，標記抗原與抗體充分反應后分離B和F，所測得的B的放射性為Bo。這是沒有標準抗原與之競爭時，標記抗原和抗體的結合達最大值。非特異結合管（NSB）：標記抗原除了要和特異性抗體結合以外，還要和一些雜質蛋白或容器的管壁等結合，對我們的分析結果產生影響。NSB管是用蒸餾水代替特異性抗體，在相同條件下反應后測得的放射性。22第六章體外分析總放射性管（T）：反應后不分離就直接測得的放射性就是總放射性。表示標記抗原抗體復合物和游離的標記抗原的總放射性。標準管（B1~Bn）：放有不同濃度的標準抗原，再加入相同量的標記抗原和特異抗體。一般在反應后分離出沉淀，測定沉淀的放射性作為B。樣品管（Bx）：用同劑量的樣品代替標準管中的標準抗原，在相同條件下反應和分離，同樣取沉淀測得其放射性，就可以在繪制的標準曲線上找到樣品的濃度。23第六章體外分析選用不同的反應變量作縱坐標，標準曲線的形狀也不同。常用的有B%，B/F，B/Bo，F(xiàn)/B，Bo/B等。24第六章體外分析標準曲線

左：橫座標為等份刻度；右：橫座標為對數(shù)刻度

25第六章體外分析（一）標準抗原是廠家給出已知劑量的非標記抗原。一般每一個RIA試劑盒里都有濃度由小到大的多瓶標準抗原。二、RIA基本試劑26第六章體外分析標準抗原的要求：1、標準抗原與待測抗原、標記抗原具有基本相同的免疫活性，即質同。他們的化學結構和化學性質要相同，對特異性抗體的親和力要相同。并且，標準抗原與待測抗原所處的介質條件要相同。27第六章體外分析2、定量要準確：整個RIA分析系統(tǒng)的定量基礎就是標準抗原的量，因此標準抗原的定量一定要準確，即與國家規(guī)定的標準品相比有良好的可比性。只有保證標準抗原的準確定量，才能保證RIA分析系統(tǒng)的準確度和精確度。28第六章體外分析3、必須高純度：標準抗原應該含有盡可能少的化學雜質，以避免雜質對反應和計量的影響。4、穩(wěn)定性要好：要保證在試劑盒的運輸、儲存和在實驗過程中應該不發(fā)生降解，分離、破壞等。29第六章體外分析1）比活度和放化純度足夠高比活度——每微克抗原上標記放射性核素的千貝可數(shù)（KBq/μg）放化純度——具有免疫活性的標記抗原占總放射性的百分數(shù)。>90%2）半衰期足夠長3）保持原有抗原的特性大分子：125I小分子：3Hor125I（二）標記抗原30第六章體外分析標記抗原的要求1、質同，即標記抗原與標準抗原、待測抗原的化學性質和免疫活性要相同。2、標記抗原要有適當高的放射性比活度。比活度高則在允許的相同的測量統(tǒng)計誤差的前提下，所使用的標記抗原的量必然減少，那么在反應中與之競爭的待測抗原的量也相應減少，方法的靈敏度就提高了。但過高的比活度，也會引起諸如輻射自分解和免疫活性受損的問題。31第六章體外分析3、標記抗原要有足夠高的放射化學純度，一般要大于95%。放射化學純度不高，可能使一些放射性的雜質對RIA的免疫反應和動力學參數(shù)產生影響。由于存在放射性核素的衰變，因此在長期儲存后的標記抗原一般要經過重新提純后才能再次使用。32第六章體外分析4、標記抗原的穩(wěn)定性要好：和標準抗原相比，標記抗原由于有了放射性核素射線的影響，更容易發(fā)生分解。在標記抗原的儲存上，應遵循標記化合物的保存原則即低溫、降低比放射性、清除自由基等。33第六章體外分析（三）特異性抗體包括多克隆抗體和單克隆抗體?？贵w的質量之間關系到RIA分析方法的靈敏度和特異性。34第六章體外分析抗體的要求（三高）高親和力高特異性高滴度35第六章體外分析抗體的檢測指標1、親和常數(shù)K（affinityconstant）：親和常數(shù)反應了抗體與抗原的親和力。K值越大，形成抗體抗原復合物速度快，解離少，靈敏度高，準確度和精確度都好。K=結合常數(shù)k1/解離常數(shù)k2

。36第六章體外分析2、交叉反應率：指抗體識別相應抗原類似物的能力，反應了抗體的特異性。在生物體內的復雜環(huán)境中，許多生物活性物質都有很多相似的類似物，例如甲狀腺素中就有T3、T4、rT3等，雌激素里又有雌二醇、雌三醇等。交叉反應率越低，則說明抗體與抗原類似物的交叉反應就越小，其識別抗原類似物的能力就越強，特異性就越強。37第六章體外分析常用50%置換法來測定交叉反應的百分率。即將被測物質和其類似物，分別作競爭抑制曲線，比較兩者在其結合率為零管（B/B0）的50%時的劑量響應濃度，其比值即為交叉反應百分率，也就是該抗體對被測物某種類似物的相應活力。38第六章體外分析3、滴度：又稱稀釋度，反映了抗血清中有效抗體的濃度。指在沒有標準抗原存在的時候，結合50%的標記抗原時抗血清的稀釋度。其方法就是用緩沖液將抗血清稀釋為不同的濃度，各置于試管中，然后各加一定量的標記抗原進行反應，等到反應平衡后分離B和F，測出B的放射性，算出B%，以B%為縱坐標以抗血清的稀釋度為橫坐標作出抗血清稀釋曲線，B%為50%所對應的抗血清滴度為工作滴度。39第六章體外分析三、RIA的分離方法指分離標記抗原抗體復合物（B）和游離標記抗原（F）的方法。根據(jù)使用的分離劑不同可以分為：非特異性分離方法：利用物理、化學或生物化學的方法如吸附、過濾、沉淀等。特異性分離方法：利用免疫反應的特異性來進行分離的方法如雙抗體法等。40第六章體外分析（一）分離方法的要求分離完全、快速。不影響免疫反應的平衡，即是要求在分離過程中不使抗原-抗體復合物解離或形成新的復合物。受環(huán)境因素（溫度、PH值等）的影響小。操作簡便，分離劑來源豐富、價廉。41第六章體外分析（二）非特異性分離方法1、吸附法：利用表面活性物質將反應液中的中小分子，即游離部分F吸附，離心后將大分子B留在上清夜中達到分離的目的。常用的表面活性物質是葡聚糖凝膠和活性碳顆粒。42第六章體外分析2、過濾法：用一定規(guī)格孔徑的濾膜過濾，大分子不能通過而留在濾膜上，達到分離的目的。常用0.22μm的醋酸纖維薄膜。43第六章體外分析3、沉淀法：在溶液中，大分子的標記抗原抗體復合物由一層水分子膜所包被，使其能夠溶解在溶液里。在溶液中加入一定量的沉淀劑如聚乙二醇，乙醇等可以破壞大分子的水包膜，使大分子互相靠攏，形成更大的分子而沉淀下來。44第六章體外分析（三）特異性分離方法1、雙抗體法：用待測抗原的抗體（第一抗體，Ab1）作為抗原去免疫另一種屬的動物而產生新的抗體（第二抗體，Ab2），Ab2可以和Ab1特異性結合而形成更大的Ag-Ab1-Ab2三聯(lián)復合物而沉淀。此法特異、高效、非特異結合低、重復性好。45第六章體外分析2、固相法：

將第二抗體用一定的方法涂在試管等容器的內壁上，然后直接在試管內進行反應，平衡后抗原抗體復合物連接在試管壁上，直接將上清液倒掉后就可以測定試管的放射性，十分方便。46第六章體外分析3、磁性微粒分離技術是一種新興的分離技術。磁性微粒是用高分子材料和金屬離子如Fe3O4為原料，聚合而成的一種以金屬離子為核心，外層則均勻地包裹高分子聚合體的固相微粒。47第六章體外分析使用時磁性微粒經過特異性抗體包被制成的免疫磁性微粒以懸浮液狀態(tài)存在于反應溶液中，在反應中與抗原結合形成復合體后，當受外加磁場吸引的作用磁性微粒可快速沉降而自行分離，無需離心沉淀，因而使操作過程大為簡化。48第六章體外分析磁化分離技術的突出優(yōu)點是：（1）非特異結合率低；（2）磁化固相顆粒在反應系統(tǒng)呈懸浮狀態(tài)，便于和抗原結合，縮短了反應平衡時間；（3）磁化顆粒表面積大，制成的固相抗體可含較多的抗體量；（4）利用磁性分離架，不用抽吸，分離完全，操作簡便。49第六章體外分析四、測量儀器1.γ射線探測器（γ免疫計數(shù)器）：γ射線2.液體閃爍計數(shù)器(liquidscintillationcounter)：β射線50第六章體外分析五、RIA的優(yōu)點1、靈敏度高：一般化學分析法的檢出極限為10-3～10-6g，而RIA通常為10-9(ng)、10-12(pg)，甚至10-15(fg)、10-18(ag)

51第六章體外分析2、特異性強：

RIA是基于抗原抗體免疫結合反應，由于抗原—抗體免疫反應專一性強。良好的特異性抗體，能識別化學結構上非常相似的物質，甚至能識別立體異構體。被測物-----抗原52第六章體外分析3、應用范圍廣：據(jù)不完全統(tǒng)計，目前至少已有300多種生物活性物質已建立了RIA。它幾乎能應用于所有激素的分析（包括多肽類和固醇類激素），還能用于各種蛋白質、腫瘤抗原、病毒抗原、細菌抗原、寄生蟲抗原以及一些小分子物質（如環(huán)型核苷酸等）和藥物（如地高辛、毛地黃甙等）的分析。近年來由于小分子半抗原制備抗體的技術有很大的發(fā)展，有人預測幾乎所有的生物活性物質，只要其含量不低于RIA的探測極限，都可建立適當?shù)腞IA法。53第六章體外分析4、操作簡便，商品化程度高：RIA所需試劑品種不多，便于制成配套試劑盒；加樣程序簡單,一次能分析大量標本；反應時間不長；測量和數(shù)據(jù)處理易于實現(xiàn)自動化；RIA屬體外分析技術，對患者無任何輻射危害。操作簡便，成本低。血清、血漿、體液、組織勻漿等樣品不加提純就可直接測量。

54第六章體外分析六、RIA的質量控制一個理想的、沒有誤差的“完美”測定，應該是標本樣品的分析物無論是在一次測定中的任何位置，無論是重復測定幾次，甚至在不同實驗室所測得的結果都是一樣的，而且所測值就是這個樣品的真值。但是，在實際工作中，這種理想的測定是不可能達到的。任何一種分析方法都會產生誤差。55第六章體外分析一個完善的質量控制體系應包括兩個環(huán)節(jié)：1、生產廠家應該建立嚴格的質量檢測程序。2、實驗室應該有嚴格的質量控制體系。包括實驗室內部質量控制（室內質控）和實驗室間的質量控制（室間質控）。56第六章體外分析（一）誤差的分類和來源：根據(jù)來源不同的誤差，可以把實驗中產生的誤差分為兩類：系統(tǒng)誤差隨機誤差57第六章體外分析1、系統(tǒng)誤差：是由于試劑、儀器或操作方法上一個固定的缺陷而造成整批結果傾向性的偏差，影響了結果的正確性。系統(tǒng)誤差引起的測定結果的偏差是固定的偏大或偏小。系統(tǒng)誤差是可以避免的。58第六章體外分析2、隨機誤差：是由于實驗過程中各種偶然因素造成同一樣品多次測定的結果不一致。誤差的出現(xiàn)是隨機的，與真實值的偏離是雙向性的，可大可小。隨機誤差無法避免。59第六章體外分析（二）質量控制質量控制就是使用合適的方法以檢查、表示和消除來自試劑藥盒和測量體系的誤差，并使這種誤差降低到某一允許水平。具體作用有：1．檢查誤差的程度，決定測定結果的取舍。2．識別誤差的來源并消除其原因。3．改進測定方法的設計以提高質量。60第六章體外分析（三）RIA質量控制指標包括實驗室內部質量控制和實驗室間的質量控制。實驗室內部的質量控制側重于對檢測質量的控制，保證從樣品收集到發(fā)出結果報告的整個過程中能及時發(fā)現(xiàn)各種誤差，并分析原因，找出糾正的方法。質量控制的指標包括：精密度、準確度、靈敏度、特異性、穩(wěn)定性61第六章體外分析1、精密度（precision）：精密度是指在一定條件下，同一實驗方法對同一樣品多次重復測定所得到的結果之間的離散程度，即結果的一致性。主要反映隨機誤差的大小。主要用變異系數(shù)或繪制精密度圖的方法來評價。62第六章體外分析2、準確度（accuracy）：是指測量值與真值的符合程度，其偏離真值的誤差就叫做偏差。在實際工作中我們用設置質控樣品、測定回收率或進行健全性評價的方法來判斷準確度。63第六章體外分析（1）質量控制樣品質量控制樣品是含有已知劑量待測物的血清樣本。質控樣品和待測樣品為同一種物質，具有相同的生物和免疫活性。質控樣品的濃度應準確定量并有合理的濃度范圍。通常是根據(jù)待測物在人體血清內的正常濃度制定高、中、低三個劑量水平的質控樣品。使用時將質控樣品分置在待測樣品的不同位置中同時檢測。64第六章體外分析（2）回收率的測定：

設置回收管和對照管，在對照管中加入待測樣品，回收管中加入等量待測樣品和已知量的分析物，經過反應后計算其回收率。一般的回收率的要求是90％～110％。65第六章體外分析（3）健全性評價：主要用于評價標準品與待測樣品的免疫活性是否一致。用反應緩沖液將樣品稀釋成不同的劑量，繪制樣品稀釋曲線，如果樣品與標準品免疫活性相同，得到的曲線應該是一組平行的曲線，所以又稱為平行性實驗。66第六章體外分析3、靈敏度（sensitivity）：是指RIA方法剛能與不含有標準抗原的零標準管在統(tǒng)計學上區(qū)別開來的抗原最低劑量，即該RIA方法的最小可檢測量。確定靈敏度的方法主要有：

①同一樣品10次測量結果的B/B0＝90％的劑量的平均值作為最小可測量。

②以10次測量結果的B0管結合率均值減去2SD（標準差）的結合率的劑量對應值為最小可測量。67第六章體外分析4、特異性：方法的特異性主要取決于抗體的特異性。用抗體的交叉反應率來表示。5、穩(wěn)定性：測量結果的穩(wěn)定性可以通過劑量反應曲線的各個參數(shù)的穩(wěn)定性來間接反映。如標準曲線的斜率和截距，零標準管結合率的75%、50%、25%處的劑量值(ED75、ED50、ED25等)。68第六章體外分析七、RIA的方法學（一）反應方式：1、平衡加樣法：也稱一步法，是將非標記抗原、標記抗原和抗體同時加入反應體系進行反應。優(yōu)點：使非標記抗原、標記抗原兩者與抗體有相同的反應幾率，操作方便，精密度較好，穩(wěn)定性好。缺點：反應時間長，靈敏度較差69第六章體外分析2、順序加樣法：先將非標記抗原與抗體溫育反應一定時間（6～24小時），形成抗原抗體復合物后，然后再加入標記抗原短時間（1～4小時）溫育后中止反應。優(yōu)點：使非標記抗原與抗體結合的幾率比標記抗原高，提高了非標記抗原的競爭能力，提高了方法的靈敏度。70第六章體外分析（二）反應介質：1、緩沖液：(pH值：7.4～7.8)緩沖液為RIA提供一個適合的反應環(huán)境，是RIA成敗的關鍵。常用的緩沖液有磷酸鹽緩沖液，Tris-HCL緩沖液等。2、離子強度：0.05～0.1mol/l離子強度過高會抑制抗原抗體反應，過低會降低緩沖能力，引起反應系統(tǒng)PH值的變化，同樣會影響抗原抗體反應。71第六章體外分析3、添加劑：0.5％牛血清白蛋白：減少反應試管對微量抗原、抗體的吸附。0.01mol/lEDTA鈉鹽：多功能的螯合劑，可以去除樣品中的鈣鎂離子。0.05％疊氮鈉：防腐劑。

72第六章體外分析（三）反應的溫度和時間溫度升高，抗原抗體結合的親和力要下降，溫度每升高10℃，抗原抗體結合達到平衡的速度約提高一倍，達到平衡的時間縮短，反應時間縮短。溫度降低，親和常數(shù)提高，增加了反應的靈敏度。73第六章體外分析（四）操作基本步驟RIA的操作一般包括加樣、孵育、分離、測量和數(shù)據(jù)處理5個部分。加樣：注意所有的試管加樣總體積要保持一致，所處的介質環(huán)境也要一致。孵育：根據(jù)不同的分析對象孵育的溫度和時間不同，一般是37℃。分離：選擇好的分離方法進行分離。測量：測量游離或結合物部分的放射性。數(shù)據(jù)處理：繪制標準曲線和待測物濃度的計算。74第六章體外分析免疫放射分析immunoradiometricassay,IRMA75第六章體外分析*Ab+Ag-*Ab+*AbAg（B）（F）在體外條件下,利用Ag與過量的*Ab的非競爭性結合反應，通過測定放射性復合物的量來計算出Ag量的一種超微量分析技術。基本原理76第六章體外分析基本原理免疫放射分析是一種非競爭性的抗原抗體反應，是用過量的放射性標記抗體來測定樣品中的抗原，其中標記抗體是過量的，抗原全部是非標記的。將放射性核素標記在抗體上，用過量的抗體與抗原結合，反應平衡后，用分離方法除去多余的抗體，測量抗原-標記抗體復合物的放射性。利用抗原-標記抗體復合物的放射性活度與抗原劑量之間的函數(shù)關系來測定待測抗原的量。77第六章體外分析IRMA的基本方法根據(jù)IRMA的分離方法一般可以分為：1、雙抗夾心法:（最常用）

將分離抗體涂在反應容器的壁上，稱固相抗體。固相抗體先于抗原反應，形成固相抗體－抗原復合物，再與標記抗體反應，形成固相抗體－抗原－標記抗體復合物附著在管壁上，傾去上清液直接測量反應容器的放射性。78第六章體外分析79第六章體外分析

2、標記第三抗體法：

用雙抗夾心法中的第二抗體（標記抗體）作為抗原免疫其他的動物獲得的抗體為第三抗體。反應后得到固相抗體－抗原－第二抗體－標記第三抗體的復合物。一般第三抗體是由兔抗鼠IgG的抗血清制成的，對于所有使用小鼠IgG作為第二抗體的反應系統(tǒng)都能形成抗原抗體復合物，又稱為通用性標記抗體。80第六章體外分析3、生物素－親和素系統(tǒng)：一個抗體分子可以連接多個生物素分子，而每一個生物素分子都可以連接一個親和素且連接很緊密。用放射性核素標記親和素，可以使這個IR