肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法-編制說明

一、項目來源根據《廣西標準化協會關于下達2022年第十八批團體標準制修訂項目計劃的通知》（桂標協〔2022〕56號）精神，由廣西壯族自治區(qū)藥品監(jiān)督管理局提出，廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所、廣西-東盟食品檢驗檢測中心、廣西愛生生命科技有限公司、深圳華大智造科技股份有限公司共同起草的團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》（項目編號2022-1801）獲批立項。二、項目背景及目的意義禽肉是我國第二大肉類消費品。我國肉類消費常年穩(wěn)定在8000萬噸以上，主要以豬肉、禽肉、牛肉和羊肉為主。根據國家統計局公布的數據顯示，2019年我國居民人均肉類消費量為26.91kg/年，其中人均豬肉消費量為20.28kg/年，人均牛肉消費量為2.2kg/年，人均羊肉消費量為1.19kg/年，人均禽類消費量為10.8kg/年。2020年我國居民豬牛羊肉人均占有量37.38kg/年。隨著我國國民經濟水平及人民生活水平的大幅提高，動物源性食品在我國城鄉(xiāng)居民的日常膳食消費中所占比例逐年增長，同時消費者對動物源性食品的質量安全越來越關注。近年來部分不法分子為了追求高利潤，用價格低廉的肉類替代產品標簽中的高價肉類，對消費者造成欺詐，嚴重影響及破壞食品安全秩序。牛肉在世界肉類消耗中排名第三，牛肉中含有大量的蛋白質和氨基酸，牛肉的肉類結構組織更適合人類的需要，可以增加人體的抗病能力，對于長身體的孩子來說非常有益。牛肉可以起到補血的功效，缺血可以用牛肉來補。牛肉也是食肉朋友的最愛，在美國等國家牛肉成為主食，甚至美式早餐中都有牛肉的身影。第一種，用其他肉類來代替牛肉。用廉價的肉類來代替牛肉是商販最常用的手段，多是用雞肉和鴨肉這類肉來代替，有的會用豬肉代替?；蛟S會有疑問，為什么這類肉會有牛肉的味道呢？制作假牛肉是會放入牛肉精添加劑，加入牛肉精后肉類的顏色和光澤會變得和不相上下，最后再用肉精膏涂抹均勻，這樣制作出的假牛肉簡直和真牛肉一模一樣。第二種是合成肉，這類肉多是用牛肉的邊角料，或者用其他肉類、爛肉做出。制作這種假牛肉更是簡單，只需將碎肉用類似于“粘合劑”的添加劑粘合起來，就成了以假亂真的牛肉了。這種牛肉多會制作成價格低廉的牛排、烤肉中的牛肉片、火鍋中的肥牛等。第三種是利用各種爛肉、內臟風干制成的牛肉干。這種肉含有大量的添加劑，對人體傷害非常大。目前國內外用于肉制品的摻假檢驗以PCR-RFLP、多重PCR、實時熒光PCR等方法為主。然而，這些技術一般每次僅能檢測一種或兩種指標，無法全面分析檢測食品中所涉及的多種動物源性成分，當遇到幾個不同品種的混合樣品時，要確定每個品種在混合物中的相對量需要找到品種中唯一的已知目標序列作為參考序列，要獲得精確的測定結果非常困難，并且現有檢測方法難以滿足高效快速、批量大、大規(guī)模、操作簡單等檢測需求，無法滿足市場監(jiān)管、企業(yè)原料及成品質量實時控制的迫切需求。因此，制定團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》十分必要和緊迫。三、項目編制過程（一）成立標準編制工作組團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》項目任務下達后，廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所牽頭組織成立了標準編制工作組，制定了標準編寫方案，明確任務職責，確定工作技術路線，開展標準研制工作，具體由廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所、廣西-東盟食品檢驗檢測中心、廣西愛生生命科技有限公司、深圳華大智造科技股份有限公司相關人員配合。（二）收集整理文獻資料標準編制工作組收集了國內有關實驗室生物安全和高通量測序的相關技術文獻資料。主要有：SN/T2557-2010畜肉食品中牛成分定性檢測方法實時熒光PCR法GB/T5009.1食品衛(wèi)生檢驗方法理化部分總則GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法GB19489實驗室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因測序技術規(guī)程GB/T33681.1高通量基因測序樣本預處理方法第1部分：動物組織樣本預處理GB/T35537高通量基因測序結果評價要求GB/T40664用于高通量測序的核酸類樣本質量控制通用要求（三）研討確定標準主體內容標準編制工作組在對收集的資料進行整理研究之后，標準編制工作組召開了標準編制會議，對標準的整體框架結構進行了研究，并對標準的關鍵性內容進行了初步探討。經過研究，標準的主體內容確定為擴增子測序法的檢測原理、試劑和材料、主要儀器設備、樣本采集與處理、檢測方法、結果分析及判定。（四）調研及形成草案、征求意見稿、2022年7月，在前期工作的基礎之上，通過理清邏輯脈絡，整合已有的參考資料中有關高通量測序的要求，并結合動物源性成分檢測方法實際要求的基礎上，按照簡化、統一等原則編制完成團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》（草案）。2023年3月，標準編制工作組對前期的研究和數據進了整理并結合前期技術咨詢會、征求意見會、技術審查會的內容針對擴增子測序法進行多次討論、研究，最終形成團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》（征求意見稿）和編制說明。四、標準制定原則（一）實用性原則本文件是在充分收集相關資料和文獻，分析動物源性成分檢測方法當前現狀，調研高通量測序分析方法情況，在現有國家、行業(yè)標準相關動物源性成分檢測方法要求的基礎上，結合多年經驗而總結起草的。符合當前動物源性成分檢測方法的方向與需求，有利于行業(yè)的長遠發(fā)展，具有較強的實用性和可操作性。（二）協調性原則本文件編寫過程中注意了與高通量測序方法相關法律法規(guī)的協調問題，在內容上與現行法律法規(guī)、標準協調一致。（三）規(guī)范性原則本文件嚴格按照GB/T1.1—2020《標準化工作導則第1部分：標準化文件的結構和起草規(guī)則》的要求和規(guī)定編寫本標準的內容，保證標準的編寫質量。（四）前瞻性原則本文件通過擴增子測序法，驗證分析肉類樣品，建立動物源性產品中肉類摻假檢測分析平臺，彌補擴增子高通量測序法在標準領域的缺失，在標準中體現了個別特色性、前瞻性和先進性條款，作為對動物源性成分檢測方法的指導。五、標準主要章節(jié)內容及確定依據團體標準《肉類產品動物源性成分檢測方法擴增子測序法》主要內容包括術語和定義、要求、檢測原理、試劑和材料、主要儀器設備、樣本采集與處理、檢測方法、結果分析及判定。自2012年起，廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所就開始對肉類產品中動物源性成分進行檢測，完成幾百份樣品的檢測分析，數據量豐富，在不斷的試驗過程中試驗方法得到不斷完善，最終形成準確度高、可操作性強的動物源性成分檢測方法。本標準采用高通量測序法對動物源性成分進行測定。術語和定義高通量測序high-throughputgenesequencing主要依據GB/T30989《高通量基因測序技術規(guī)程》3.19的“高通量測序high-throughputgenesequencing”術語和定義的要求。原理選取線粒體16SrRNA基因中的特殊區(qū)域作為動物物種的遺傳標記，包括可變區(qū)和保守區(qū)，可變區(qū)用于在屬或種水平對動物物種進行分類。采用帶有index序列的特定引物，對待測樣本的DNA樣本進行PCR擴增建庫，并對所構建的文庫進行高通量測序。然后，通過對測序數據進行生物信息學比對，分析能比對到物種數據庫中對應的物種及其數據量比例，即可對混合樣品中的各成分進行準確定性和定量分析。試劑除另有規(guī)定外，所有試劑應為不含DNA和Dnase的分析純或生化試劑，實驗用水應符合GB/T6682一級水的要求。CTAB提取液：CTAB20g/L，氯化鈉1.4mol/L，Tris0.1mol/L，EDTA20mmol/L，pH8.0，121℃高壓滅菌20min。使用前加入終濃度為2%的β-巰基乙醇。CTAB沉淀液：CTAB5g/L，氯化鈉0.04mol/L，pH8.0，121℃高壓滅菌20min。測序試劑盒：根據測序目標和平臺，選用相應的試劑盒。標準文庫試劑：基于測序平臺，選用相應的標準文庫。儀器設備磁力架，孔徑：12mm；適用于1.5-2mL離心管。移液器，單道可調量程移液器0.1-2.5μL、0.5-10μL、10-100μL、100-1000μL。PCR儀。Qubit?Fluorometer。高速冷凍離心機。恒溫水浴鍋或金屬浴。-20℃冰箱。核酸濃度測定儀器。電泳儀。凝膠成像系統。高通量基因測序儀：基于不同的測序平臺，選用合適的測序儀。Bioanalyzer芯片生物分析儀。樣本采集與處理1.樣本采集要求樣本的采集、運輸、放置過程中應盡量避免受到其它種類樣本的污染。在采樣過程中應確保采樣器具清潔、干燥、無異味。采樣、制樣器具及樣本容器所用材質不應對采集樣本造成污染。為了避免交叉污染，盡可能使用不同的采樣器具采集不同的樣本，盛裝樣本的容器或包裝應盡可能一次性使用。本標準中檢測樣本為動物組織及其產品，采樣要求參照GB/T5009.1中8的要求。2.樣本處理要求動物組織樣本處理應符合GB/T33681.1的要求，并按8.1中核酸制備樣本處理步驟進行前處理。加工食品的前處理方法宜參考SN/T2557-2010中的要求。檢測方法1.核酸提?。?）樣本應提取全基因組DNA，提取方法宜參考附錄A或者按照所使用的商業(yè)化試劑盒說明提取。（2）提取后的核酸應進行質量評價，使用合適的核酸濃度測定儀器（如紫外分光光度計，nanodrop等）測定OD260/OD280，比值為1.5～2.0，基因組的完整性和濃度應符合GB/T40664-2021中4.2要求。2.建庫與高通量測序（參考附錄B或附錄C）（1）擴增區(qū)域應選擇線粒體16SrRNA基因上一段連續(xù)的，在不同物種間變異程度較高的區(qū)域。擴增區(qū)域應在樣品可能包含的物種間具有較高的差異性，且應包括至少一個高可變區(qū)。擴增區(qū)域應符合測序策略要求的片段大小。（2）將待測序文庫應進行質量控制檢測。按照瓊脂糖凝膠電泳方法或者熒光定量方法進行文庫質控，文庫質檢時，文庫的片段大小分布應符合預期，文庫濃度應不低于1.2ng/μL。建庫過程中宜設置陰性對照與陽性對照。（3）將多個質檢合格的文庫混合，選擇適合的工作流程進行測序。測序應遵照DNA測序儀的操作規(guī)范進行。測序策略應與擴增子大小相匹配，測序條件應進行合理控制，使數據質量達到測序平臺要求。（4）測序結果應符合GB/T35537-2017要求。結果分析及判定根據需要鑒定的物種拉丁名在NCBI數據庫(/nuccore)中獲取各個物種的特異性序列，構建用于本地數據分析的物種數據庫。高通量測序得到的數據中，篩選有效OTU的前50個堿基序列，與物種數據庫基因序列進行比對，相似度100%的物種則為該肉類樣品中的有效成分；統計各成分物種有效OTU的reads數，得到不同物種的百分比例，認為該比例是該肉類樣品中各成分的比例，精確定量可參考各物種中參考基因的拷貝數與質量對應表推算。1.數據質控樣本經過測序得到的原始數據，應進行質量控制，去除含有接頭或者低質量的序列和外源基因組序列，再進行后續(xù)生物信息學分析。2.軟件測序結果比對（1）定性比對分析：使用AnimalDNAMetabarcodingAnalysis軟件，將質控得到的樣品數據FASTQ文件，比對物種基因組數據庫，分析得到物種的拉丁名和基因序列。（2）定量比對分析：使用AnimalDNAMetabarcodingAnalysis軟件，統計比對到各成分物種基因序列中前50個堿基的比例，該比例認為是樣品中各成分的比例。3.網頁測序結果比對登錄動物DNA宏條形碼鑒定分析平臺（:9003），完成測序結果分析。方法的準確度選取9個不同物種進行檢測，按試驗方法，使用不同品牌測序儀在2家實驗室進行比對試驗，測定結果見表1。分析結果與樣品組分一致，而且同一樣品在2家實驗室使用不同品牌測序儀獲得的測試結果一致。說明本方法的準確度好，具有普遍性，適合推廣使用。表1樣品準確度檢測結果實驗室/測序儀編號組分測序結果總Reads數鑒定物種物種比例廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所/IlluminaMiseqzhu豬318813Sus_scrofa100.00%ji雞25836Gallus_gallus100.00%niu牛80729Bubalus_bubalis100.00%mao貓19852Felis_catus100.00%ge鴿52306Columba_livia100.00%shu鼠29863Mus_musculus100.00%yang羊358281Ovis_aries100.00%xia蝦83754Penaeus_latisulcatus100.00%ya鴨27632Anas_platyrhynchos100.00%深圳華大智造科技股份有限公司/MGIDNBSEQ-E25zhu豬1070046Sus_scrofa100.00%ji雞621948Gallus_gallus100.00%niu牛1019269Bubalus_bubalis100.00%mao貓1472329Felis_catus100.00%ge鴿481137Columba_livia100.00%shu鼠725382Mus_musculus100.00%yang羊1016920Ovis_aries100.00%xia蝦718355Penaeus_latisulcatus100.00%ya鴨1057980Anas_platyrhynchos100.00%方法的精密度按實驗方法對混合有不同物種的2個樣品進行測定，選取3家實驗室進行比對試驗，分別得出2個平行樣的測定結果,見表2。從測定結果可以看出，其相對標準偏差(RSD值)均小于8％，說明方法的精密度高。而且在重復條件下3家實驗室獲得的測試結果的RSD值均小于2％。表2樣品精密度測定結果實驗室/測序儀編號組分（比例/%）測序結果Reads數鑒定物種（比例/%）平均值（％）RSD（％）廣西壯族自治區(qū)食品藥品檢驗所/IlluminaMiseqHE-1牛：50羊：5050902Bos_taurus:51.74Ovis_aries:48.26Bos_taurus:52.29Ovis_aries:47.71Bos_taurus:1.49Ovis_aries:1.63HE-2牛：50羊：5034778Bos_taurus:52.84Ovis_aries:47.16HF-1牛：99羊：124886Bos_taurus:98.23Ovis_aries:1.77Bos_taurus:98.32Ovis_aries:1.68Bos_taurus:0.13Ovis_aries:7.58HF-2牛：99羊：149670Bos_taurus:98.41Ovis_aries:1.59廣西國際旅行衛(wèi)生保健中心（南寧海關口岸門診部）/IlluminaMiseqHE-1牛：50羊：5033567Bos_taurus:53.01Ovis_aries:46.99Bos_taurus:52.78Ovis_aries:47.22Bos_taurus:0.60Ovis_aries:0.67HE-2牛：50羊：5060956Bos_taurus:52.56Ovis_aries:47.44HF-1牛：99羊：179037Bos_taurus:98.56Ovis_aries:1.44Bos_taurus:98.58Ovis_aries:1.42Bos_taurus:0.03Ovis_aries:1.99HF-2牛：99羊：147236Bos_taurus:98.60Ovis_aries:1.40深圳華大智造科技股份有限公司/MGIDNBSEQ-E25HE-1牛：50羊：501015420Bos_taurus:52.23Ovis_aries:47.77Bos_taurus:52.69Ovis_aries:47.31Bos_taurus:1.23Ovis_aries:1.38HE-2牛：50羊：503434882Bos_taurus:53.15Ovis_aries:46.85HF-1牛：99羊：1849283Bos_taurus:98.30Ovis_aries:1.70Bos_taurus:98.27Ovis_aries:1.73Bos_taurus:0.04Ovis_aries:2.45HF-2牛：99羊：12683836Bos_taurus:98.24Ovis_aries:1.76六、國內外同類標準制修訂情況及與法律法規(guī)、強制性標準關系經查閱，與肉類產品動物源性成分檢測方法相關的國家標準、行業(yè)標準及地方標準有：SN/T2051-2008《食品、化妝品和飼料中牛羊豬源性成分檢測方法實時PCR法》、SN/T2980-2011《動物產品中牛、山羊和綿羊源性成分三重實時熒光PCR檢測方法》、SN/T37