DB22T 2010-2014 家畜(豬牛羊)戊型肝炎病毒的測定RT-PCR法

備案號：41804-2014DB22DB22/T2010—2014家畜（豬牛羊）戊型肝炎病毒的測定RT-PCR法DetectionofHepatitisEvirusbyRT-PCRinLivestock（pig/cattle/sheep）吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布12GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗戊型肝炎病毒科成員。一種單股正鏈RNA病毒，呈球形、直徑27～34nm，無囊膜，核衣殼呈二十面體立體對稱。病毒基因組長約7.2knt，有3個開放閱讀框（ORF1、ORF2、ORF聚合酶鏈反應(yīng)polymerasechainreaction[PCR]反應(yīng)組成一個PCR循環(huán)，經(jīng)過多次循環(huán)反應(yīng)反轉(zhuǎn)錄reversetranscription[RT]35'-AAATYAATTCTGTCGGR注：R=A/G，Y=C/T，W=A/T，H=A/CDNA分子質(zhì)量標準可采用100bpDNAladderMaker、DNAMarkerDL2000或其它等效產(chǎn)）：45.5高速臺式冷凍離心機：1200挑取0.5g~1.0g糞便樣品于1.5mL離心管內(nèi)，加入滅菌的1mol/LPBS溶液，旋渦震蕩混勻，制備成10%的糞便懸液，4℃8000r/min離心10mi取上述處理好的樣品100μL于1.5mL無RNA酶離心管中，每管加入1000μLTrizol試劑，混勻，室溫放置5min；加入200μL氯仿，混勻，室溫放置5m以下保存，盡快使用。本操作應(yīng)在一個無RNA酶（Rnase）的條5）：加完試劑后瞬時離心混勻。72℃5min，冰?。悍磻?yīng)總體積為25μL。加完試劑后瞬時離心混勻。將PCR反應(yīng)：42℃反應(yīng)1h；然后95℃滅活反轉(zhuǎn)錄酶存?zhèn)溆?。本加樣操作?yīng)在一個無RNA酶（Rnase）的條在冰浴條件下，按下列試劑用量在PCR反應(yīng)管中分別）：）：）：）：）：6徹底延伸10min；4℃保存。PCR產(chǎn)物可直接將凝膠托架水平放置在工作臺上，并放上梳子。稱取1.0g瓊脂糖于三角燒瓶中，加入100mL1倍Tris-硼酸電泳緩沖液，用微波爐加熱溶解瓊乙錠（EB）溶液5μL，使其終濃度為0.5μg/mL，充分8.1將電泳后的瓊脂糖凝膠置于紫外光透射儀或凝膠成7）：將0.1mLDEPC加入100mL雙蒸水中配成0.1%的水溶液，室或在室溫下磁力攪拌20min，然后1.034×105Pa高壓滅菌30min，室溫保存。DE致癌物，開瓶取用時應(yīng)使瓶子盡可能小心謹慎，避免溶液因內(nèi)部壓力）：在100mL雙蒸水中加入1.0g溴化乙錠（EB用鋁解，然后移至棕色瓶中，保存于室溫。溴化乙錠（EB）是強誘變劑并有中度毒性，使用含有這種染料——蔗糖：40.0g；）：8A.5.10.5mol/LEDTA（pH8.0）的配制）：——雙蒸水：定容至1000mL；在800mL雙蒸水中加入186.1gEDTA-Na2pH值至8.0（約需20.0g氫氧化鈉顆粒），然后定容至1000mL，分裝后1.034×105Pa高壓滅菌30室溫保存?！鹚幔?7.5g；）：——氯化鈉：8.0g；——氯化鉀：0.2g；9tacatggatcacctgtgaattcttacactaatacaccttacactggtgctctcggcctgctcgatttgcgcttgagcttgagttcgtaatctacacggtttatg