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備案號:51404-2016DB32PCRinspectionspecificationofcyprinidherpesvirusⅡ江蘇省質量技術監(jiān)督局發(fā)布I本標準主要起草人:陳輝、袁銳、方蘋、倪金俤、劉訓猛、陳靜、郭立新、1鯉皰疹病毒Ⅱ型PCR檢測方法凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改單)GB/T6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試SC/T7014-2008水生動物產地3.5MgCl2(25mmol/L生化試劑,-20℃保存。2GoldviewTM核酸染料或其他宜使用的核酸4儀器和設備有臨床癥狀的魚,如體長不超過4cm,取鰓;體長為4cm~636.1.2加入600μL酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)至樣品離心管中,持續(xù)上下顛倒用力混合至少1min,12000r/min4℃離心10min,小心取上層水相(約700μL)置于新的1.5mL離心管中。),6.1.4加入-20℃預冷的1.5倍體積無水乙醇(約900μL倒轉數次混勻后,置-20℃沉淀1h以上。6.1.512000r/min4℃離心30min,小心去上清,倒置于吸DNA抽提也可選用商品化病毒DNA抽提試劑盒,按相應說明書提供的方法予以抽提。50μL體系10×PCR緩沖液(無Mg2+)51×MgCl2(25mmol/L)5dNTP(10mmol/L)12100pmol/μL引物F111pmol/μL100pmol/μL引物R111pmol/μL滅菌雙蒸水TaqDNA聚合酶(5U/μL)0.025U/μL待檢DNA模板或對照546.3.2將平板放入水平電泳槽,電泳緩沖液剛好淹6.3.3加樣:10μL樣品加入2μL樣品緩沖液,混勻后加入樣品孔。6.3.5紫外燈下觀察核酸帶,并7.2當PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢5試劑及其配制A.1CTAB溶液A.2酚—三氯甲烷—異戊醇A.3三氯甲烷—異戊醇A.4TBE電泳緩沖液(5×濃縮液)A.56×DNA上樣緩沖液61CCCAGCAACATGTGCGACGGAGGCATCAG61TTCTGTCTCGAGTATGTCAGAAACTGCGTGCTGCTCGATTGGAAAAAGA121AGTAACATGGAAGAGATCAAGGAATACCCGCACA181TACAAGAACCGAGAGGTCGGTTGGACTCGGTTTG241CACTACCTCTCTATGAGATCTCAGTACAAGAAACGCATCAAGACCGA301CTCAAGGCGTACTATGATCAGATGCAGGGTGAGATGAAAGTATGCGC361GGCGTGAGCCAGAGTCTCTGTCAGCATCTGACTACTTGGT421CTGGTCGAGAACGCTGTAAAACACACTCCGGGTATGACC7

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