高效液相色譜法課件

08-高效液相色譜法1第八章高效液相色譜法08-高效液相色譜法28.1概述

第八章高效液相色譜法8.2高效液相色譜儀8.3主要分離類型和原理8.4高效液相色譜固定相8.5高效液相色譜流動相

8.6影響分離的因素8.7分離類型的選擇

08-高效液相色譜法38.1概述1.高效液相色譜法

在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入氣相色譜的理論而發(fā)展起來的，以液體為流動相的現(xiàn)代柱色譜分離分析方法。HPLC:采用高壓輸液泵，高效微粒固定相和高靈敏度檢測器。08-高效液相色譜法4

經(jīng)典LCHPLC柱之內(nèi)徑1~5cm~0.4cm長度50~100cm15~50cm填充材料粒度150μm~200μm4μm~10μm使用壓力1~10atm50~200atm分離時間0.5h~天0.05~1h2.高效液相色譜和經(jīng)典液相色譜的比較8.1概述08-高效液相色譜法58.1概述3.高效液相色譜和氣相色譜的比較分析對象及范圍：GC——氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物——只占有機(jī)物總數(shù)的20%；HPLC——高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物——占有機(jī)物總數(shù)的80%。08-高效液相色譜法68.1概述流動相的選擇：GC——有限的幾種“惰性”氣體，只起運載作用，對組分作用?。籋PLC——液體或各種液體的混合——除了起運載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。08-高效液相色譜法78.1概述4.高效液相色譜法的特點

高柱效優(yōu)點：“三高”“一快”“一廣”

高靈敏度

高選擇性

分析速度快

應(yīng)用范圍廣泛（可分析80%有機(jī)化合物）缺點：儀器設(shè)備費用昂貴，操作嚴(yán)格08-高效液相色譜法88.1概述5.高效液相色譜法的適用對象

高效液相色譜適用于分析高沸點不易揮發(fā)的、受熱不穩(wěn)定易分解的、分子量大、不同極性的有機(jī)化合物；

生物活性物質(zhì)和天然產(chǎn)物；

合成和高分子化合物，以及無機(jī)和有機(jī)離子型化合物。08-高效液相色譜法98.1概述6.高效液相色譜法的應(yīng)用

生命科學(xué)：氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)，核堿、核苷、核苷酸、核酸（RNA、DNA）等生命物質(zhì)的純化和分析；

藥物分析：合成藥物的純化及質(zhì)量控制，中草藥有效成分的分離、制備及純度測定以及臨床醫(yī)學(xué)的藥代動力學(xué)研究中的分離分析。08-高效液相色譜法108.1概述食品分析：

①食品本身組成,特別是營養(yǎng)成分，如糖、有機(jī)酸、維生素、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪的分析；②食品添加劑，如防腐劑、抗氧化劑、合成色素、甜味劑和保鮮化學(xué)物質(zhì)的分析；③食品污染物，如農(nóng)藥殘余和黃曲霉素等的分析。08-高效液相色譜法118.1概述環(huán)境監(jiān)測：

用于分子量大,揮發(fā)性低、熱穩(wěn)定性差的有機(jī)污染物的分離和分析。

如多環(huán)芳烴、酚類、多氯聯(lián)苯、鄰苯二甲酸酯類、聯(lián)苯胺類、陰離子和非離子表面活性劑、有機(jī)農(nóng)藥等。08-高效液相色譜法128.1概述

精細(xì)化工：具有較高分子量和較高沸點的有機(jī)化合物，如高碳數(shù)脂肪族或芳香族的醇、醛和酮、醚、酸、酯等化工原料，以及各種表面活性劑、藥物、農(nóng)藥、染料、炸藥等化工產(chǎn)品的分析。

制備分離:

在許多科學(xué)研究和生產(chǎn)領(lǐng)域，往往需要制備或提取一些高純化合物。08-高效液相色譜法138.2.1示例8.2.2結(jié)構(gòu)8.2.3主要部件8.2高效液相色譜儀08-高效液相色譜法148.2.1示例08-高效液相色譜法158.2.1示例08-高效液相色譜法168.2.1示例08-高效液相色譜法178.2.2結(jié)構(gòu)08-高效液相色譜法18色譜柱進(jìn)樣器泵及控制器數(shù)據(jù)處理及控制在線脫氣機(jī)檢測器8.2.3主要部件08-高效液相色譜法198.2.3主要部件1.高壓輸液系統(tǒng)

由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液罐、高壓輸液泵、過濾器、壓力脈動阻力器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。

08-高效液相色譜法20機(jī)械注射泵機(jī)械往復(fù)泵多用于流量要求在1-50

L/min范圍的微型HPLC或毛細(xì)管柱HPLC中

活塞泵隔膜泵8.2.3主要部件高壓輸液泵

要求：密封性好，輸出流量恒定，壓力平穩(wěn)，可調(diào)流量范圍寬，耐腐蝕。分類：恒流泵（機(jī)械泵）恒壓泵08-高效液相色譜法218.2.3主要部件1.高壓輸液系統(tǒng)馬達(dá)往復(fù)式拉動密封溶劑球閥脈動阻尼器到色譜柱機(jī)械往復(fù)柱塞泵示意圖08-高效液相色譜法22在分離過程中使用兩種或兩種以上不同極性的溶劑按一定程序連續(xù)改變它們之間的比例，使流動相的強(qiáng)度、極性、pH或離子強(qiáng)度發(fā)生變化，從而改變被測組分的相對保留值，提高分離效率。作用類似于氣相色譜中的程序升溫。8.2.3主要部件2.梯度淋洗裝置08-高效液相色譜法23外梯度（高壓梯度）:

利用兩臺高壓輸液泵，將兩種不同極性的溶劑按一定的比例送入梯度混合室，混合后進(jìn)入色譜柱。8.2.3主要部件8.2.3主要部件08-高效液相色譜法24內(nèi)梯度（低壓梯度）:

一臺高壓泵,通過比例調(diào)節(jié)閥,將兩種或多種不同極性的溶劑按一定的比例抽入高壓泵中混合。8.2.3主要部件8.2.3主要部件08-高效液相色譜法253.進(jìn)樣系統(tǒng)8.2.3主要部件

直接注射進(jìn)樣：操作方便，可獲得高的柱效，但不能承受高壓；進(jìn)樣方式

停留進(jìn)樣：高壓泵停止供液，體系壓力下降時，將樣品直接加入到柱頭。此法操作不便，重現(xiàn)性差，不得已才用；

高壓六通閥進(jìn)樣：進(jìn)樣量的可變范圍大，耐高壓，易于自動化。但容易造成色譜峰柱前擴(kuò)寬。它是目前普遍采用的進(jìn)樣方式。08-高效液相色譜法268.2.3主要部件高壓六通閥進(jìn)樣08-高效液相色譜法278.2.3主要部件柱體為直型不銹鋼管，內(nèi)徑1～6mm，柱長5～40cm。

發(fā)展趨勢是減小填料粒度和柱徑以提高柱效。4.色譜柱08-高效液相色譜法288.2.3主要部件（1）紫外檢測器5.檢測器

應(yīng)用最廣，對大部分有機(jī)化合物有響應(yīng)。

對流動相的流速和溫度變化不敏感；

流通池可做的很?。?mm

10mm，容積8

L）；

線形范圍寬；

靈敏度高；

波長可選，易于操作；

可用于梯度洗脫。08-高效液相色譜法298.2.3主要部件（1）紫外檢測器08-高效液相色譜法308.2.3主要部件（2）光電二極管陣列檢測器1024個二極管陣列，分別檢測特定波長，經(jīng)計算機(jī)快速處理，得到三維立體譜圖紫外檢測器的重要進(jìn)展08-高效液相色譜法318.2.3主要部件08-高效液相色譜法328.2.3主要部件（3）示差折光檢測器

除紫外檢測器之外應(yīng)用最多的檢測器；是一種通用型檢測器（每種物質(zhì)具有不同的折光指數(shù)）；

可連續(xù)檢測參比池和樣品池中流動相之間的折光指數(shù)差值。差值與濃度呈正比；

靈敏度低、對溫度敏感、不能用于梯度洗脫；

有偏轉(zhuǎn)式、反射式和干涉型三種；08-高效液相色譜法33光源調(diào)零光學(xué)零參比樣品平面鏡透鏡光電轉(zhuǎn)換記錄儀放大器遮光板原理：利用兩束相同角度的光照射溶劑相和樣品+溶劑相，利用二者對光的折射率不同，其中一束（通常是通過樣品+溶劑相）光因為發(fā)生偏轉(zhuǎn)造成兩束光的強(qiáng)度差發(fā)生變化，將此差示信號放大并記錄，該信號代表樣品的濃度。08-高效液相色譜法348.2.3主要部件

高靈敏度、高選擇性；

對多環(huán)芳烴，維生素B、黃曲霉素、卟啉類化合物、農(nóng)藥、藥物、氨基酸、甾類化合物等有響應(yīng)；（4）熒光檢測器08-高效液相色譜法358.3主要分離類型和原理8.3.1液-固吸附色譜8.3.2液-液分配色譜8.3.3離子交換色譜和離子色譜8.3.4尺寸排阻色譜8.3.5親和色譜08-高效液相色譜法368.3.1液－固吸附色譜

基本原理：組分在固定相吸附劑上的吸附與解吸

適用對象：分離相對分子質(zhì)量中等的油溶性試樣，對具有官能團(tuán)的化合物和異構(gòu)體有較高選擇性；08-高效液相色譜法37（1）.類型

硅膠

氧化鋁

分子篩

聚酰胺（2）.結(jié)構(gòu)

全多孔型

薄殼型5～10μm（3）.粒度

固定相：固體吸附劑，較常使用的是5～10μm的硅膠吸附劑；08-高效液相色譜法388.3.1液－固吸附色譜

液固吸附色譜的流動相：各種不同極性的一元或多元溶劑。

缺點：非線形等溫吸附常引起峰的拖尾

流動相：液相色譜的流動相又稱為：淋洗液，洗脫劑。流動相的組成、極性改變，可顯著改變組分分離狀況。選擇原則：極性大試樣—極性較強(qiáng)溶劑；

極性小試樣—弱極性溶劑。08-高效液相色譜法39基本原理：組分在固定相和流動相上的分配。

(相對溶解度的差異)

流動相：

親水性固定液，采用疏水性流動相，即流動相的極性小于固定液的極性(正相

normalphase)，反之流動相的極性大于固定液的極性(反相

reversephase)。

正相與反相的出峰順序相反。8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法40正、反相色譜中極性和保留時間的關(guān)系待測物極性：A>B>C8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法41（1）.全多孔型擔(dān)體

由氧化硅、氧化鋁、硅藻土等制成的多孔球體；

早期采用100μm的大顆粒，表面涂漬固定液，性能不佳已不多見；

現(xiàn)采用10μm以下的小顆粒，化學(xué)鍵合制備柱填料；固定相8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法42

（2）.表面多孔型擔(dān)體

（薄殼型微珠擔(dān)體）

30～40μm的玻璃微球，表面附著一層厚度為1～2μm的多孔硅膠。表面積小，柱容量低。8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法43（3）.化學(xué)鍵合固定相

硅氧碳鍵型：≡Si—O—C

硅氧硅碳鍵型：≡Si—O—Si—C

硅碳鍵型：≡Si—C

硅氮鍵型：≡Si—N類型：8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法44

傳質(zhì)快，表面無深凹陷，比一般液體固定相傳質(zhì)快；

壽命長，化學(xué)鍵合，無固定液流失，耐流動相沖擊；耐水、耐光、耐有機(jī)溶劑，穩(wěn)定；

選擇性好，可鍵合不同官能團(tuán)，提高選擇性；

有利于梯度洗脫；特點：8.3.2液－液分配色譜08-高效液相色譜法45分離機(jī)制（由鍵合基團(tuán)的覆蓋率決定）

高覆蓋率：分配為主；

低覆蓋率：吸附為主；8.3.2液－液分配色譜

適用對象：正相色譜法適用于極性化合物的分離；反相色譜法適用于非極性化合物的分離。08-高效液相色譜法468.3.3離子交換色譜

基本原理：

組分在固定相上發(fā)生反復(fù)離子交換反應(yīng)；組分與離子交換劑之間親和力的大小與離子半徑、電荷、存在形式等有關(guān)。親和力大，保留時間長；陽離子交換：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+；

陰離子交換：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-08-高效液相色譜法478.3.3離子交換色譜

流動相：

陰離子交換樹脂作固定相，采用酸性水溶液；

陽離子交換樹脂作固定相，采用堿性水溶液；

應(yīng)用：

離子及可離解的化合物，氨基酸、核酸等。08-高效液相色譜法488.3.3離子交換色譜結(jié)構(gòu)類別薄殼型離子交換樹脂：薄殼玻璃珠為擔(dān)體，表面涂約1%的離子交換樹脂離子交換鍵合固定相：薄殼鍵合型；全多孔微粒硅膠鍵合型（鍵合離子交換基團(tuán)）固定相：陰離子交換樹脂（堿性）

或陽離子交換樹脂（酸性）08-高效液相色譜法49

由離子交換色譜法派生出來。與離子交換色譜的區(qū)別：

8.3.4離子色譜法采用了特制的、具有極低交換容量的離子交換樹脂作為柱填料，并采用淋洗液抑制技術(shù)和電導(dǎo)檢測器，是測定混合陰離子的有效方法。08-高效液相色譜法508.3.4離子色譜法在離子交換分離柱后加一根抑制柱，降低流動相的電導(dǎo)

----抑制型離子色譜或雙柱離子色譜采用電導(dǎo)率極低的溶液作流動相

----非抑制型離子色譜或單柱離子色譜08-高效液相色譜法518.3.5離子對色譜

原理：

將一種（或多種）與溶質(zhì)離子電荷相反的離子加到流動相中，與溶質(zhì)離子結(jié)合，形成疏水性離子對化合物，根據(jù)其吸附作用的不同在兩相之間進(jìn)行分配；

改變離子對試劑的濃度，可改變分離的選擇性。應(yīng)用：離子型或可離子化的化合物08-高效液相色譜法528.3.5離子對色譜

陰離子分離：常采用烷基銨類，如氫氧化四丁基銨或氫氧化十六烷基三甲銨作為對離子；

陽離子分離：常采用烷基磺酸類，如己烷磺酸鈉作為對離子；

反相離子對色譜：非極性的疏水固定相(C-18柱)，含有對離子Y+的甲醇-水或乙腈-水作為流動相，試樣離子X-進(jìn)入流動相后，生成疏水性離子對Y+X-后；在兩相間分配。08-高效液相色譜法538.3.5尺寸排阻色譜原理：按分子大小分離。小分子可以擴(kuò)散到凝膠空隙，由其中通過，出峰最慢；中等分子只能通過部分凝膠空隙，中速通過；大分子被排斥在外，出峰最快；溶劑分子小，故在最后出峰。全部在死體積前出峰；

應(yīng)用：

高聚物的分子量分布08-高效液相色譜法548.3.5尺寸排阻色譜固定相：

凝膠(具有一定大小孔隙分布)因此也稱為凝膠色譜(1).軟質(zhì)凝膠葡聚糖凝膠、瓊脂凝膠等多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)；水為流動相。適用于常壓排阻分離。08-高效液相色譜法552.半硬質(zhì)凝膠苯乙烯-二乙烯基苯交聯(lián)共聚物，有機(jī)凝膠；非極性有機(jī)溶劑為流動相，不能用丙酮、乙醇等極性溶劑。3.硬質(zhì)凝膠多孔硅膠、多孔玻珠等；孔徑可控，具有恒定孔徑和窄粒度分布?；瘜W(xué)穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性好、機(jī)械強(qiáng)度大，流動相性質(zhì)影響小，可在較高流速下使用。8.3.5尺寸排阻色譜08-高效液相色譜法568.3.6親和色譜

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某種特異性親和力，進(jìn)行選擇性分離。

間隔基：

環(huán)氧、聯(lián)胺等；配基：酶、抗原等；08-高效液相色譜法578.3.6親和色譜這種固載化的配基將只能和具有親和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改變淋洗液后洗脫。應(yīng)用：

具有特殊親和力的生物分子08-高效液相色譜法58類型主要分離機(jī)理主要分析對象或應(yīng)用領(lǐng)域吸附色譜吸附能，氫鍵異構(gòu)體分離、族分離，制備分配色譜疏水分配作用各種有機(jī)化合物的分離、分析與制備尺寸排阻色譜溶質(zhì)分子大小高分子分離，分子量及其分布的測定離子交換色譜庫侖力無機(jī)離子、有機(jī)離子分析離子排斥色譜Donnan膜平衡有機(jī)酸、氨基酸、醇、醛分析離子對色譜疏水分配作用離子性物質(zhì)分析疏水作用色譜疏水分配作用蛋白質(zhì)分離與純化手性色譜立體效應(yīng)手性異構(gòu)體分離，藥物純化親和色譜生化特異親和力蛋白、酶、抗體分離，生物和醫(yī)藥分析HPLC按分離機(jī)理的分類

08-高效液相色譜法598.4高效液相色譜流動相1.流動相類別

按流動相組成分：單組分和多組分；按極性分：極性、弱極性、非極性；

按使用方式分：固定組成淋洗和梯度淋洗。

常用溶劑：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。08-高效液相色譜法608.4高效液相色譜流動相3.流動相選擇在選擇溶劑時，溶劑的極性是選擇的重要依據(jù)；

采用正相液-液分配分離時：首先選擇中等極性溶劑，若組分的保留時間太短，降低溶劑極性，反之增加；也可在低極性溶劑中，逐漸增加其中的極性溶劑，使保留時間縮短。08-高效液相色譜法618.4高效液相色譜流動相

常用溶劑的極性順序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六環(huán)>四氫呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>異丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>環(huán)己烷>己烷>煤油(最小)08-高效液相色譜法628.4高效液相色譜流動相

采用二元或多元組合溶劑作為流動相可以靈活調(diào)節(jié)流動相的極性或增加選擇性，以改進(jìn)分離或調(diào)整出峰時間?！荻攘芟?8-高效液相色譜法638.4高效液相色譜流動相4.選擇流動相時應(yīng)注意的幾個問題

盡量使用高純度試劑作流動相，防止微量雜質(zhì)長期累積損壞色譜柱和使檢測器噪聲增加。

化學(xué)惰性好，不與固定相發(fā)生作用而使柱效下降或損壞柱。如使固定液溶解流失；酸性溶劑破壞氧化鋁固定相等。08-高效液相色譜法648.4高效液相色譜流動相

試樣在流動相中應(yīng)有適宜的溶解度，防止產(chǎn)生沉淀并在柱中沉積。

低黏度。黏度太大會降低樣品組分的擴(kuò)散系數(shù)，造成傳質(zhì)減慢，柱效下降，同時引起柱壓升高。

流動相同時還應(yīng)滿足檢測器的要求。如當(dāng)使用紫外檢測器時，流動相不應(yīng)有紫外吸收。08-高效液相色譜法658.5影響分離的因素1.提高柱效的途徑在高效液相色譜中，液體的擴(kuò)散系數(shù)僅為氣體的萬分之一，則速率方程中的分子擴(kuò)散項B/u較小，可以忽略不計，即：液相色譜H-u曲線與氣相色譜的形狀不同，如圖所示：H=A+Cu08-高效液相色譜法66

液體的粘度比氣體大一百倍，密度為氣體的一千倍，故降低傳質(zhì)阻力是提高柱效主要途徑。

由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。

液相色譜中，不可能通過增加柱溫來改善傳質(zhì)。一般采用恒溫。

改變淋洗液組成、極性是改善分離的最直接的因素。P282-2848.5

影響分離的因素08-高效液相色譜法678.5影響分離的因素2.流速對分離的影響但在實際操作中，流量仍是一個調(diào)整分離度和出峰時間的重要可選擇參數(shù)。流速大于0.5cm/s時,H～u曲線是一段斜率不大的直線。降低流速，柱效提高不是很大。08-高效液相色譜法688.5影響分離的因素3.固定相和色譜柱的影響氣相色譜中的固定液原則上都可以用于液相色譜，其選用原則與氣相色譜一樣。

但在高效液相色譜中，分離柱的制備是一項技術(shù)要求非常高的工作，一般很少自行制備。08-高效液相色譜法698.6分離類型的選擇1.根據(jù)相對分子質(zhì)量選擇

相對分子質(zhì)量非常低的樣品，其揮發(fā)性好，適用于氣相色譜。

標(biāo)準(zhǔn)液相色譜類型（液-固、液-液、及離子交換色譜）最適合的相對分子質(zhì)量范圍是200-2000。

對于相對分子質(zhì)量大于2000的樣品，則用尺寸排阻法為最佳。08-高效液相色譜法702.根據(jù)溶解度選擇

弄清樣品在水、異辛烷、苯、四氯化碳、異丙醇中的溶解度是很有用的。8.6分離類型的選擇

如果樣品可溶于水并屬于能離解物質(zhì)，以采用離子交換色譜為佳；

如樣品可溶于烴類（如苯或異辛烷），則可采用液-固吸附色譜；08-高效液相色譜法712.根據(jù)溶解度選擇8.6分離類型的選擇

如樣品溶解于四氯化碳，則多采用常規(guī)的分配和吸附色譜分離；

如樣品既溶于水又溶于異丙醇時，常用水和異丙醇的混合液作液-液分配色譜的流動相，以憎水性化合物作固定相。08-高效液相色譜法728.6分離類型的選擇3.根據(jù)分子結(jié)構(gòu)選擇

用紅外光譜法預(yù)先簡單地判斷樣品中存在什么官能團(tuán)。然后確定采用什么方法合適。

酸、堿化合物用離子交換色譜；

脂肪或芳香族用液-液分配色譜、液一固吸附色譜；

異構(gòu)體用