DB32T 4565-2023 埃及血吸蟲核酸檢測重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法　　

埃及血吸蟲核酸檢測重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法發(fā)出布版發(fā)出布版江蘇省市場監(jiān)督管理局Ⅰ本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由江蘇省衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：江蘇省血吸蟲病防治研究所、首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院、江蘇省血液中心、江蘇省國際旅行衛(wèi)生保健中心（南京海關(guān)口岸門診部）。何健。1埃及血吸蟲核酸檢測重組酶介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法本文件描述了檢測人體尿液中埃及血吸蟲核酸的重組酶介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增法。本文件適用于各級(jí)疾病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)和醫(yī)療機(jī)構(gòu)對(duì)埃及血吸蟲核酸的檢測。注：埃及血吸蟲的基本信息、流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)見附錄A。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法。3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。重組酶介導(dǎo)核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)recombinase-aidedamplification；RAA一種利用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶在等溫條件下（一般為39℃)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的技術(shù)。注：其原理為重組酶與引物緊密結(jié)合掃描雙鏈DNA，當(dāng)搜索到與引物同源的序列時(shí)，使雙鏈DNA解旋，單鏈結(jié)合蛋白防止單鏈DNA復(fù)性，引物在DNA聚合酶作用下沿模板鏈延伸，合成新的DNA互補(bǔ)鏈，5min~15min就可實(shí)現(xiàn)用儀器檢測目的靶標(biāo)的擴(kuò)增。4儀器與設(shè)備4.1RAA恒溫核酸擴(kuò)增檢測儀帶有恒溫（39℃±1℃)擴(kuò)增功能的熒光檢測儀。熒光檢測激發(fā)波長480nm，發(fā)射波長520nm。4.2恒溫振蕩混勻儀帶有恒溫功能（39℃±1℃),且能把固體、液體物質(zhì)充分混勻。4.3離心機(jī)相對(duì)離心力≥1500g。4.4微量可調(diào)移液器量程為100μL~1000μL、20μL~200μL、2μL~20μL及0.5μL~10μL。2DB32/T4565—20235試劑與材料5.1試劑體液核酸提取試劑盒、RAA擴(kuò)增反應(yīng)體系及緩沖液（也可采用等效的商品試劑盒）、無水乙醇和水（符合GB/T6682的要求）。5.2材料離心管（50mL、1.5mL）及離心管架、PCR管（0.2mL）及管架、微量可調(diào)移液器配套吸頭、一次性使用敷料鑷、一次性醫(yī)用手套和一次性醫(yī)用口罩。5.3引物與探針擴(kuò)增埃及血吸蟲細(xì)胞色素C氧化酶相關(guān)基因（COX1）基因的特異性引物及探針，如表1所示。表1埃及血吸蟲COX1基因引物與探針引物/探針序列（5'?3'）正向引物CTTGATTATATATGCTTAAAAGCTGTGGGTC反向引物TAAAGCTATACCAGTAACACCACCTATCGT探針aCTGTGGGTCTCGTGTATGAGATCCTATAGTTTGATGATTGGTTGGTTTTAa探針序列的第31位堿基修飾熒光報(bào)告基團(tuán)羧基熒光素（FAM）、第35位堿基修飾淬滅基團(tuán)以及第33位堿基修飾四氫呋喃殘基。6樣本前處理與核酸提取6.1樣本樣本為受試者尿液。6.2樣本采集6.2.1登記受檢者編號(hào)信息，將樣本信息貼于潔凈尿液收集容器上。6.2.2采集受檢者上午10點(diǎn)至下午2點(diǎn)之間的尿液，避免糞便污染，女性應(yīng)避開生理期留取尿液樣本。6.2.3肉眼觀察尿液顏色與性狀（淡黃、帶血或血尿等）并作記錄，搖動(dòng)混勻后采集尿液5mL~10mL，加蓋密封保存。6.2.4采集后應(yīng)及時(shí)送檢，室溫下保存時(shí)間不超過4h；不能及時(shí)送檢的，應(yīng)在4℃冷藏，保存時(shí)間不超過24h。6.3核酸提取6.3.1將采集的尿液移入離心管中，1500g離心5min或靜置15min。6.3.2傾倒或吸棄上清尿液，取200μL尿沉渣樣本，使用體液核酸提取試劑盒，按照操作說明提取核酸。6.3.3取2μL制備好的核酸樣本進(jìn)行檢測，或保存至-20℃?zhèn)溆谩?7核酸檢測7.1向含有RAA反應(yīng)體系的PCR管（見附錄B）中加入45.5μL緩沖液。7.2在反應(yīng)管的管蓋中加入2.5μL乙酸鎂。7.3將2μL陰性質(zhì)控品加入反應(yīng)管中作為陰性對(duì)照，然后將2μL待測樣本依次加入不同反應(yīng)管中，最后將2μL陽性質(zhì)控品加入反應(yīng)管作為陽性對(duì)照，各反應(yīng)管總體系為50μL。7.4將反應(yīng)管置于恒溫振蕩混勻儀中，在39℃下振蕩混勻4min。7.5將反應(yīng)管置于RAA恒溫核酸擴(kuò)增檢測儀（也可采用其他等效的熒光檢測儀）中進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測，設(shè)置8結(jié)果判定8.1陽性判定8.1.1反應(yīng)結(jié)束后，設(shè)置斜率為20，儀器將進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，自動(dòng)呈現(xiàn)判定結(jié)果。8.1.230min內(nèi)，擴(kuò)增曲線的斜率≥20時(shí)判定為陽性；否則判定為陰性，見附錄C。8.2質(zhì)量控制8.2.1陽性質(zhì)控品檢測結(jié)果判定為陽性；陰性質(zhì)控品檢測結(jié)果判定為陰性。8.2.2如檢測結(jié)果不符合8.2.1的要求，該試驗(yàn)視為無效，應(yīng)檢查儀器、試劑等的偏差，確認(rèn)無誤后重新檢測。4（資料性）基本信息、流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)A.1基本信息埃及血吸蟲為雌、雄異體。雄蟲短粗，乳白色，大小為12mm~20mm。雌蟲前細(xì)后粗，形似線蟲，深褐色，大小為12mm~28mm，雌雄蟲呈合抱狀。成蟲雌雄合抱逆血流移行至腸系膜下靜脈、痔上靜脈，多數(shù)成蟲至膀胱靜脈與盆腔靜脈叢產(chǎn)卵，部分蟲卵破入膀胱腔，可經(jīng)尿液排出體外。其流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)參見A.2。A.2流行病學(xué)及臨床表現(xiàn)埃及血吸蟲是寄生于人體的主要6種血吸蟲之一，引起埃及血吸蟲病。病人和帶蟲者是本病的傳染源，極少見其他哺乳動(dòng)物感染。埃及血吸蟲病患者尿中蟲卵污染河流、池塘等水源，埃及血吸蟲毛蚴鉆入水泡螺發(fā)育被為尾蚴并逸出，尾蚴通過皮膚或黏膜侵入人體?；颊咭赞r(nóng)民、漁民為主，男女無差別。埃及血吸蟲病主要在非洲和東地中海地區(qū)的53個(gè)國家流行，分別為非洲的阿爾及利亞、安哥拉、貝個(gè)東非國家（馬達(dá)加斯加、莫桑比克和坦桑尼亞）為重度流行區(qū)。埃及血吸蟲病可輸入中國等非流行地區(qū)。埃及血吸蟲可寄生于宿主而引起泌尿生殖道疾病，臨床上常有終末血尿、膀胱刺激和尿路梗阻等癥狀，常與其他原因致泌尿系統(tǒng)感染疾病混淆而導(dǎo)致誤診，晚期可引起腎功能衰竭，甚至危及生命。此外，在膀胱組織中沉積的蟲卵易導(dǎo)致慢性感染，可進(jìn)一步引發(fā)膀胱鱗狀細(xì)胞癌。5DB32/T4565—2023（資料性）埃及血吸蟲RAA反應(yīng)體系反應(yīng)體系中各成分及使用濃度如下：Tris緩沖液30mmol/L、醋酸鉀100mmol/L、乙酸鎂20mmol/L、二硫蘇糖醇6mmol/L、聚乙二醇（PEG?35000）6%（體積分?jǐn)?shù)）、ATP5mmol/L、dNTPs0.4mmol/L、磷酸肌酸80ng/μL、單鏈結(jié)合蛋白500ng/μL、重組酶200ng/μL、UvsY蛋白200ng/μL、核酸外切酶200ng/μL、熒光探針150nmol/L、DNA聚合酶150ng/μL、正向引物400nmol/L和反向引物400nmol/L。6(資料性)圖C.1給出了RAA法檢測結(jié)果判讀示意圖。7DB32/T4565—2023［1］楊坤.公共衛(wèi)生援非項(xiàng)目理論與實(shí)踐援桑給巴爾血吸蟲病防治[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.2021.［2］WorldHealthOrganization.（2022）.WHOguidelineoncontrolandeliminationofhumanschisto?somiasis.WorldHealthOrganization.https：///iris/handle/10665/351856.［3］WorldHealthOrganization.（2021）.Diagnostictargetproductprofilesformonitoring，evaluationandsurveillanceofschistosomiasiscontrolprogrammes.WorldHealthOrganization.https：///iris/handle/10665/344813.［4］YangK，MehlhornH.Cham.Sino?AfricanCooperationforSchi