浙江大學(xué)生物工程學(xué)復(fù)習(xí)提綱

1.名詞解釋(1)基因組(genome)ThesumofallthegenesandintergenicDNAonallthedifferentchromosomesofacellisreferredtoasthecellulargenome.(2)DNA測(cè)序法Sanger(dideoxy)method:以DNA單鏈作為模板，加入DNA聚合酶和四種dNTP，分別加入少量的ddNTP，在聚合酶的作用下，ddNTP隨機(jī)摻入復(fù)制鏈中，由于ddNTP的3’端沒有羥基，加入后終止聚合反應(yīng)，形成不同長度的DNA片段。將這些寡核苷酸片段進(jìn)行電泳分析(能區(qū)分長度僅差一個(gè)核苷酸)，并用35S放射自顯影，讀出DNA上的核苷酸序列。(3)RFLP（p123ofGeneVI）RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)限制性片段長度多態(tài)性（限制性片段指“限制性內(nèi)切酶酶切片段”）即同種不同個(gè)體的基因組在用同一種限制性內(nèi)切酶作用時(shí)，限制性酶切圖不同的現(xiàn)象?！蚕拗菩悦盖袌D與基因功能無關(guān)，它的多態(tài)性也不一定導(dǎo)致表現(xiàn)型的改變，可以作為geneticmarker〕(4)SNP（Singlenucleotidepolymorphisms）SNP指基因組水平上由單核苷酸改變引起的DNA序列多態(tài)性。它是人類可遺傳變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90%，是遺傳變異的關(guān)鍵指標(biāo)。SNP在人類基因組中廣泛存在，平均每500到1000個(gè)堿基對(duì)就有一個(gè)SNP發(fā)生，估計(jì)總數(shù)可達(dá)300萬個(gè)，甚至更多。SNP既能在編碼區(qū)又能在非編碼區(qū)中發(fā)生。總的來說，位于編碼區(qū)的SNP（codingSNP）較少，但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義。由于特殊基因上的SNP很可能對(duì)疾病易感性、對(duì)于環(huán)境因子和藥物的反應(yīng)有所作用，所以引起了許多科學(xué)家和制藥公司重視。在我國強(qiáng)伯勤主持的中華民族基因組SNP研究計(jì)劃也于今年啟動(dòng)。另外，人類基因組計(jì)劃旨在解讀人類分布在24條染色體上的30億對(duì)堿基。面對(duì)如此龐大信息量，人類基因組測(cè)序的策略是以作圖為基礎(chǔ)，將染色體分為易操作的結(jié)構(gòu)區(qū)域。第三代分子標(biāo)記就是SNP，這使得遺傳圖譜的制作日益精密。（第一代是限制性酶切片段長度多態(tài)性（RFLP），第二代是短串聯(lián)重復(fù)序列（STR））(5)遺傳圖（p122ofGeneVI）染色體上可變部位的線性排列，由基因重組實(shí)驗(yàn)推斷出來(6)物理圖AmapofthelocationsofidentifiablelandmarksonDNA.(如限制性酶切位點(diǎn))，以bp為單位。(7)葉盤法葉盤法是常用的植物轉(zhuǎn)基因方法，它是新切的對(duì)部片與農(nóng)桿菌在培養(yǎng)基上共培養(yǎng)2天，使└秩局參鏘赴僮遼稈∨溲仙稈∽說南胞（先殺死農(nóng)桿菌，再加入抗生素殺死未轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌質(zhì)粒的植物細(xì)胞）。將存活的植物細(xì)胞培養(yǎng)形成愈傷組織后,轉(zhuǎn)入合適的配養(yǎng)基中培養(yǎng)為含Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化基因的植株。(8)Ti質(zhì)粒（p443）即腫瘤誘導(dǎo)質(zhì)粒，1971年由Schell在農(nóng)桿菌中發(fā)現(xiàn)，能使植物產(chǎn)生冠癭瘤。Ti質(zhì)粒為雙鏈環(huán)狀DNA分子，約200－250kb。四個(gè)重要區(qū)域?yàn)椋簭?fù)制起始點(diǎn)OriV、致病區(qū)(Virregion)、T-DNA區(qū)和農(nóng)桿堿分解代謝區(qū)。Vir區(qū)轉(zhuǎn)錄單位對(duì)于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化細(xì)胞至關(guān)重要，但是此區(qū)只有受到植物細(xì)胞釋放的信號(hào)分子（如乙酰丁香酮、羥基乙酰丁香酮）刺激才能表達(dá)。T-DNA（transferDNA）是Ti質(zhì)粒上能被整合到植物核DNA上的片段，。含有Ocs、Roi、Shi等基因。T-DNA兩端各有一個(gè)25bp長的高度保守的正向重復(fù)序列，其中右邊界序列對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要。只要兩端序列存在且方向正確，那么，在兩端序列中間插入任何一個(gè)DNA片段都可能被轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中去。這也是我們用Ti質(zhì)粒進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)。(9)功能基因組（functionalgenomics）結(jié)構(gòu)基因組學(xué)是基因組分析的早期階段，以建立生物體高分辨率遺傳、物理和轉(zhuǎn)錄圖譜為主。功能基因組學(xué)是利用結(jié)構(gòu)基因組學(xué)提供的信息，系統(tǒng)的研究基因功能。他以高通量、大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)方法及統(tǒng)計(jì)與計(jì)算機(jī)分析為特征。(10)重組植物利用植物基因工程的手段，在離體條件下按照人們的目的對(duì)植物的DNA進(jìn)行操作，培育新的植株，達(dá)到改良植物性狀的目的，這樣獲得的植物即轉(zhuǎn)基因植物。(11)蛋白質(zhì)組（proteome）此概念是澳大利亞學(xué)者Wasinger等于1994年提出的，指的是由基因組編碼的全部蛋白質(zhì)。從這個(gè)定義看蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目應(yīng)該等于基因組內(nèi)編碼蛋白質(zhì)的基因數(shù)（準(zhǔn)確的說是ORF的數(shù)目），但在生物體內(nèi)這樣的蛋白質(zhì)組是不存在的。從基因表達(dá)的角度說蛋白質(zhì)組內(nèi)的蛋白質(zhì)數(shù)目總少于基因組中開放閱讀框的數(shù)目；但是從蛋白質(zhì)修飾的角度說蛋白質(zhì)數(shù)目又遠(yuǎn)多于基因組中開放閱讀框的數(shù)目?；蚪M基本上固定不變，而蛋白質(zhì)組是動(dòng)態(tài)的，具有時(shí)空性和可調(diào)節(jié)性，能反映基因的表達(dá)時(shí)間、表達(dá)量、蛋白質(zhì)的翻譯后加工和亞細(xì)胞分布。(12)YAC載體(yeastartificialchromosome)（p639fig20.13ofGeneVI）YAC含有在酵母中增殖一個(gè)染色體所必需的序列元素，一個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，一個(gè)確保分離進(jìn)入子細(xì)胞的著絲點(diǎn)和封閉染色體末端的端粒。YAC還帶有三個(gè)選擇標(biāo)記(selectablemarker)：TRP1、URA3和SUP4(中間含有SmaI克隆位點(diǎn))。在載入外源DNA前YAC保持環(huán)狀狀態(tài)。端粒序列后是BamH1酶切位點(diǎn)，用BamH1切割產(chǎn)生線性分子，末端是與完整的染色體相似的保證了線性分子穩(wěn)定的端粒。用SmaI酶切產(chǎn)生平齊末端，DNA可以在此插入。因此兩個(gè)酶切同時(shí)進(jìn)行就得到了兩個(gè)線性片段(two“arms”)，每一個(gè)在一端含有端粒，另一端有可以連接的平末端。每個(gè)臂有一個(gè)選擇標(biāo)記，可以用來選出兩個(gè)臂都被連接的分子。SUP4標(biāo)記的喪失使得再連接的YAC與未打開的YAC得以區(qū)分。一個(gè)YAC載體可以攜帶大量的DNA，插入300kb并不稀罕。與質(zhì)粒相比，這幾乎提高了一個(gè)數(shù)量級(jí)。(13)功能篩選（functionscreening）(14)染色體步行(chromosomewalking)（p637fig20.12ofGeneVI）我們從一個(gè)已經(jīng)分離的基因克隆開始，這個(gè)克隆含有一個(gè)已知基因，或者從遺傳圖上知道它在某個(gè)我們感興趣的區(qū)域附近。為了使大片段便于操作，我們用來自前一個(gè)克隆一端的亞片段，來分離下一個(gè)片段。具體方法：我們從原始克隆亞克隆出相應(yīng)片段(subcloning:把DNA片段從某一載體上克隆到另一載體上)。然后從文庫中辨認(rèn)出與這個(gè)克隆重疊的其他嵌合載體。這些載體將在攜帶第一個(gè)克隆片段的一端延伸。我們可以通過制作每個(gè)片段的限制性圖來確定延伸方向，這張用新的材料延伸的圖應(yīng)該含有與第一個(gè)克隆一端相同的片段。不斷重復(fù)這一過程。原則上，可能步行上百kb，并且基因組中超過1000kb的區(qū)域也曾用這種方法作圖。(15)定位克?。╬ositionalcloning）TheidentificationofagenebasedsolelyonitspositionintheGenome.經(jīng)典定位克〈粹依賴連鎖分析進(jìn)行染色體定位。定位候?克隆(positionalcandidatecloning)是它的發(fā)展與改進(jìn)。在克隆遺傳病優(yōu)點(diǎn)：不需要知道基因產(chǎn)物的功能；基因的生化、生理學(xué)、病理學(xué)、生物學(xué)特均非必需。不足：不能顯示基因產(chǎn)物的功能；對(duì)于基因功能的認(rèn)識(shí)依賴于與已知功能基因產(chǎn)物的序列同源性；基因組計(jì)劃不斷減少這一事件的可能性。(16)轉(zhuǎn)座子：(transponson)存在于染色體DNA上可自主復(fù)制和位移的基本單位，最簡(jiǎn)單的轉(zhuǎn)座子不含任何宿主基因而常被稱為插入序列（insertionsequence,IS），它是細(xì)菌染色體或質(zhì)粒DNA的正常組成部分。IS序列都是可以獨(dú)立存在的單元，帶有介導(dǎo)自身移動(dòng)的蛋白。IS兩末端為倒置重復(fù)序列，轉(zhuǎn)座時(shí)往往復(fù)制宿主靶位點(diǎn)一段DNA，形成位于IS序列兩端的正向重復(fù)區(qū)。(17)轉(zhuǎn)座子示蹤(transponsontagging)又稱轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽，原理：利用轉(zhuǎn)座子的插入造成基因突變，以轉(zhuǎn)座子序列為基礎(chǔ)，從突變株的基因文庫中篩選出帶有此轉(zhuǎn)座子的克隆，它必含有與轉(zhuǎn)座子序列相鄰的突變基因的部分序列，再利用這部分序列從野生型基因文庫中獲得完整的基因。根據(jù)目的不同，可以采取定向標(biāo)簽(directedtagging)隨機(jī)標(biāo)簽(randomtagging)兩種標(biāo)簽策略。這一方法的優(yōu)點(diǎn)是：可以在不了解基因產(chǎn)物大的生化性質(zhì)和表達(dá)模式的情況下分離克隆植物基因。2.思考題1）簡(jiǎn)述植物對(duì)人類的重要貢獻(xiàn)答：a.光合作用：利用光能CO2＋H2O制造O2和有機(jī)物，能量的“固定”b.食物來源c.環(huán)境保護(hù)：保持水土、防止風(fēng)沙；d.重要的實(shí)驗(yàn)材料e.藥物與保健品2）簡(jiǎn)述制作轉(zhuǎn)基因植物的步驟答：A.目標(biāo)基因的克隆。Strategies：a.如果有產(chǎn)物的：若為protein則測(cè)部分氨基酸序列，合成探針篩選cDNA文庫；若為DNA，則切成片段，接入表達(dá)載體表達(dá)，進(jìn)行抗體篩選和功能篩選；或者在cDNA大規(guī)模分析的基礎(chǔ)上進(jìn)行同源收縮，找出可能的目標(biāo)基因。b.無產(chǎn)物的可以采用轉(zhuǎn)座子示蹤、Ti質(zhì)粒插入法、定位克隆、cDNA差式顯示等方法克隆其基因。B.植物表達(dá)載體的構(gòu)建在基因的5’端加上啟動(dòng)子（如35S啟動(dòng)子），3’端加上終止子。C.植物的遺傳轉(zhuǎn)化主要方法有：a.Ti質(zhì)粒及Ri質(zhì)粒為載體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；b.以PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體化學(xué)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；c.電激法；d.用基因槍轉(zhuǎn)入愈傷組織后培養(yǎng)；e.顯微注射(micro-injection);f.病毒感染。D.轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的篩選及轉(zhuǎn)基因植物鑒定引起表現(xiàn)型變化的可以通過觀察表現(xiàn)型改變而找出成功轉(zhuǎn)入的植株；可以通過報(bào)告基因或篩選標(biāo)記基因來判斷；也可以在DNA、RNA、protein三個(gè)水平上鑒定轉(zhuǎn)入基因及其表達(dá)情況(Southern/Northern/Westernblotting)來確認(rèn)。3）簡(jiǎn)述用Ti質(zhì)粒（農(nóng)桿菌）轉(zhuǎn)化外源基因的分子機(jī)制答：用Ti質(zhì)粒進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的理論基礎(chǔ)是：在T-DNA兩端正向重復(fù)序列中間插入任何一個(gè)DNA片段都可能被轉(zhuǎn)移整合到植物基因組中去。另外，去掉T-DNA上的致瘤因子，造成T-DNA大段缺失，或在T-DNA上插入外源基因并不影響T-DNA的轉(zhuǎn)移整合功能。并且由于Vir區(qū)對(duì)于T-DNA的轉(zhuǎn)移是通過反式作用因子來實(shí)現(xiàn)，所以Vir區(qū)與T-DNA區(qū)可以分別位于兩個(gè)復(fù)制子上。基于以上性質(zhì)，發(fā)展出了兩個(gè)主要的Ti質(zhì)粒載體系統(tǒng)，即共整合載體系統(tǒng)和雙元載體系統(tǒng)。共整合載體系統(tǒng)(cointergratevector)，Ti質(zhì)粒上編碼致癌基因及冠癭瘤堿基序列常為一段pBR322DNA所代替，當(dāng)外源基因的pBR322衍生中間載體由大腸桿菌進(jìn)入農(nóng)桿菌細(xì)胞后，兩者相同的pBR322序列間發(fā)生同源同組，導(dǎo)致外源基因整合到Ti質(zhì)粒上。雙元載體包含兩個(gè)質(zhì)粒，它們都能在農(nóng)桿菌中復(fù)制，其中一個(gè)Ti質(zhì)粒(不含T-DNA，且左邊區(qū)與右邊區(qū)被修飾)提供Vir功能，另一個(gè)廣宿主范圍的質(zhì)粒攜帶目的基因和植物選擇性標(biāo)記基因及移動(dòng)和復(fù)制功能基因這兩種系統(tǒng)的中間載體由大腸桿菌轉(zhuǎn)移到壤農(nóng)桿菌中都需要第三種菌參與，也稱三親交配(triparentalmating).Ti質(zhì)粒的遺傳轉(zhuǎn)化：植物受傷后，傷口細(xì)胞分泌大量的酚類化合物(如乙酰丁香酮)，它們是農(nóng)桿菌識(shí)別敏感植物的信號(hào)分子。農(nóng)桿菌立即趨向這些細(xì)胞，最終導(dǎo)致T-DNA的轉(zhuǎn)移。跟據(jù)這一性質(zhì)建立了葉盤法轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。4)全基因組鳥槍法測(cè)序的主要步驟5）SNP解析的目的和意義答：a.SNP繼RFLP、STR后稱為第三代基因組作圖的多態(tài)性標(biāo)記，使得遺傳圖譜的制作更精細(xì)，并且適合自動(dòng)化大規(guī)模掃描。b.由于SNP被認(rèn)為是一種能夠穩(wěn)定遺傳的早期突變，他們之間存在著連鎖不平衡，與疾病存在著穩(wěn)定的相關(guān)性，所以SNP是研究基因組多態(tài)性和識(shí)別、定位疾病相關(guān)基因的一種新工具。c.存在于編碼區(qū)以及其緊鄰上下游序列中的SNP，可以改變基因的表達(dá)水平和表達(dá)產(chǎn)物的功能。d.特殊基因上的SNP可能直接關(guān)系到人類對(duì)于疾病的易感性和對(duì)于環(huán)境因子和藥物的反應(yīng)性。因此SNP可能將為根據(jù)個(gè)體的多態(tài)性開展藥物設(shè)計(jì)和對(duì)特殊群體制訂服藥劑量提供依據(jù)。6)如何提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性，提高熱穩(wěn)定性的必要性和可能性答：(1)可能性：噬熱菌(如有些遠(yuǎn)古細(xì)菌可以耐受100度以上的環(huán)境)以及其它生活在高溫環(huán)境下的生物體內(nèi)的酶熱穩(wěn)定。(2)必要性：酶在各種變性劑下的穩(wěn)定性是阻礙酶的廣泛使用的最大問題之一，而當(dāng)一個(gè)酶熱穩(wěn)定時(shí)，它通常很可能對(duì)于其它使其三級(jí)結(jié)構(gòu)去折疊的因素也穩(wěn)定。另外，在高溫下工作，有許多優(yōu)點(diǎn)：a.每升高10度，反應(yīng)速度加倍；b.溫度超過60度時(shí)抑制了微生物的生長；c.在許多條件下，溫度升高使底物溶解度升高，溶液粘度下降；d.對(duì)于吸熱反應(yīng)提高溫度使平衡向產(chǎn)物方向移動(dòng)。科研、生產(chǎn)中十分需要能在較高溫度下發(fā)揮作用的酶，如加酶洗衣粉。(3)方法：化學(xué)修飾、酶的固定化、蛋白質(zhì)工程、添加劑①利用自然界熱穩(wěn)定的酶尋找自然界中同源的熱穩(wěn)定的酶，一般在生活在60度以上的嗜熱微生物中。幾乎所用的嗜熱菌可以在菌種收藏中心DSM得到。如果在某種生物中酶的量適合，則用它發(fā)酵。否則克隆它的基因，插入載體轉(zhuǎn)入微生物中。如：DNA聚合酶、糖代謝酶嗜熱菌中與嗜溫菌中酶的比較一些氨基酸發(fā)生了代換：Gly->Ala、Ser->Ala、Lys->Arg等產(chǎn)生了以下影響a.堆積緊密(表面積與體積比小穩(wěn)定性高)b.靜電相互作用增加(形成更多離子對(duì)如Lys->Arg)c.增加二硫橋、增加疏水相互作用d.增加氫鍵e.微環(huán)境(滲透壓、鈣離子)f.糖基化(多聚糖保持包圍蛋白質(zhì)的水化層、與表面的親水氨基酸形成氫鍵、碳水化合物與臨近肽的立體相互作用穩(wěn)定了蛋白質(zhì)的構(gòu)象、使變性或部分變性的狀態(tài)更易溶阻止聚集、遮掩酶切位點(diǎn)，減少蛋白酶水解所必須的構(gòu)象變化)③蛋白質(zhì)工程：只有一些氨基酸的替換對(duì)于熱穩(wěn)定性的提高是必要的。蛋白質(zhì)工程方法：隨機(jī)突變、sitedirectedmutagenesis。a.randommutagenesis：制備所有可能的單位點(diǎn)隨機(jī)突變文庫，篩選熱穩(wěn)定性提高的幾個(gè)突變株，為定點(diǎn)突變提供信息；或者采用evolutionarymolecularengineering方法：編碼目標(biāo)蛋白的基因轉(zhuǎn)入極端嗜熱菌中，在必需酶才能存活的條件下培養(yǎng)，提高溫度選擇能生存的菌，測(cè)序分析突變點(diǎn)。后兩步可以重復(fù)以逐漸升溫接近要求溫度。b.sitedirectedmutagenesis：oligonucleotidesdirectedmutagenesis;overlapextensionPCR④化學(xué)修飾：是使蛋白質(zhì)穩(wěn)定化的重要和有效的方法之一必需避開活性部位關(guān)鍵基團(tuán)；交聯(lián)的原理是通過在兩部分間橋連，增加結(jié)構(gòu)的剛性，但往往降低活性；⑤酶的固定化：減少亞基分離，解聚⑥添加劑：a.個(gè)別情況下底物或底物類似物能夠穩(wěn)定酶，如NAD依賴性脫氫酶：b.表面自由能改變了蛋白質(zhì)溶液相互作用：有機(jī)分子、鹽、氨基酸鹽等c.低分子量溶質(zhì)：sugar是好的蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑，甘油有些特殊。d.聚合物溶質(zhì)如PEG對(duì)invertase的穩(wěn)定作用(4)如何作出選擇：a.收集關(guān)于蛋白的盡可能多的信息，決定最佳的目標(biāo)和我們可以采用的方法b.有時(shí)簡(jiǎn)單的添加劑比我們進(jìn)行全面的定位突變更有效的達(dá)到要求c.方法是否合適依賴于方程：interest＝剩余活力×壽命，必需考慮穩(wěn)定化過程的價(jià)格與酶的價(jià)格的比例。d.固定化酶在工業(yè)上的應(yīng)用，優(yōu)勢(shì)是不需要了解太多的酶的結(jié)構(gòu)信息，不足是酶要相對(duì)高純；隨機(jī)突變介于固定化和定位突變之間，我們只需知道cDNA信息，最終篩選出好的廉價(jià)的酶源，但并不總能成功；定位突變可以產(chǎn)生要求的氨基酸改變，可以對(duì)酶結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定及相互作用有深入的了解；酶配方(添加劑)是一個(gè)重要參數(shù)；化學(xué)修飾提供了一個(gè)有效的方法，但是無法提前預(yù)知。7)如何得到一個(gè)菌種答：獲得菌種的途徑：(1)從ATCC、CGMCC等菌種收藏中心購買(2)從自然環(huán)境中篩選(3)遺傳工程:將目標(biāo)基因插入人工質(zhì)粒中，篩選好的菌種(4)突變:通過化學(xué)、物理或者生物的方法(5)細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)：原生質(zhì)體融合在保持滲透壓平衡的條件下除去細(xì)胞壁(提高了遺傳重組率)，在融合劑(如PEG)的存在下，原生質(zhì)體融合形成雜合體或雙倍體，融合原生質(zhì)體細(xì)胞的再生。主要不足是不穩(wěn)定。8)為什么要進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)，可得到什么結(jié)果答：進(jìn)行搖瓶實(shí)驗(yàn)的目的是優(yōu)化細(xì)胞生長和產(chǎn)物生產(chǎn)的條件，為進(jìn)一步放大，直至工業(yè)化提供依據(jù)。主要條件有：a.PH值；b.溫度；c.溶氧；d.底物選擇：最大和最優(yōu)底物濃度e.其他條件：如限氮、限磷對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響等等9)如果你是一個(gè)抗生素工程師，如何設(shè)計(jì)生產(chǎn)過程答：a.分離或者從菌種收藏中心獲得待選菌種b.篩選有抗菌活性的菌種c.開發(fā)浸沒培養(yǎng)生產(chǎn)方法d.開發(fā)分離純化抗生素的方法e.確定抗生素的性質(zhì)：物理性質(zhì)，如吸附(adsorption)與吸收(absorption);化學(xué)性質(zhì)，如反應(yīng)性，溶劑中的溶解度，對(duì)于酸、堿、熱的穩(wěn)定性f.抗生素評(píng)估g.藥理實(shí)驗(yàn)h.抗菌活性i.與已有抗生素性能的比較j.開發(fā)實(shí)驗(yàn)工廠規(guī)模(pilotplant)的生產(chǎn)方法k.申請(qǐng)臨床實(shí)驗(yàn)的許可l.實(shí)驗(yàn)提純的抗生素m.開發(fā)工廠車間規(guī)模(plantscale)的生產(chǎn)方法n.獲得面向臨床應(yīng)用的生產(chǎn)許可o.其它各種各樣的考慮p.開發(fā)抗生素生產(chǎn)控制方法q.新應(yīng)用的開發(fā)r.Developmentofmarketinganddistributionsystems.Financingofbusiness10)什么是固定化酶，固定化的方法，舉例通過吸附、包埋、交聯(lián)、化學(xué)偶聯(lián)等固定化技術(shù)將水溶性的酶固定在水不溶性的載體上得到水不溶性的酶，稱為固定化酶。優(yōu)點(diǎn)是：不溶于水，易于與產(chǎn)物分離；可反復(fù)使用；穩(wěn)定性好；可連續(xù)生產(chǎn)。缺點(diǎn)是：固定化過程中往往會(huì)引起酶的失活。常用固定化技術(shù)有：微型膠囊、吸附、膠格包埋、雙功能試劑共價(jià)交聯(lián)、化學(xué)偶聯(lián)。A.微型膠囊法：酶被包埋在1-100μm的膠囊中，底物與產(chǎn)物可以自由過膜。a.相分離法(酸纖維素：β-D-半乳糖苷酶、天０訪福換棉膠：脲酶)。b.界面聚合法：尼龍66。c.液膜法：聚脲。d.液體干燥法.B.吸附法：物理吸附（靜止法，電沉積法，反應(yīng)器表面直接沉積法，蕩浴或混合浴沉積法），離子吸附（DEAE－cellulose，DEAE－sephadexA－50）C.膠格包埋法：N，N‘－甲叉雙丙稀酰胺，丙稀酰胺D.雙功能試劑交聯(lián)法：戊二醛E.不溶性載體共價(jià)耦聯(lián)法11)藍(lán)細(xì)菌generecombination常規(guī)步驟：答：a.PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片斷b.基因的分子克?。簩⒛繕?biāo)基因克隆到pUC系列的含lacZ基因的質(zhì)粒中，在X-gal平板上，通過檢查因α互補(bǔ)消失產(chǎn)生的白色菌落就可以帶有重組質(zhì)粒的藍(lán)細(xì)菌c.DNA體外重組構(gòu)建新的質(zhì)粒：genedeletion和geneinterruption質(zhì)粒的構(gòu)建d.用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化對(duì)細(xì)胞，篩選突變體質(zhì)粒：e.突變體DNA的PCR檢測(cè)和Southernblot分析12)吳慶余構(gòu)建的基因缺失突變體FRXC還能作什么工作afrxc-突變體在黑暗條件長期培養(yǎng)，藍(lán)細(xì)菌PCC6803由自養(yǎng)向異養(yǎng)轉(zhuǎn)變(利用Glucose)。這一過程必然涉及一系列基因的開啟表達(dá)。為克隆相關(guān)的基因提供了可能。b葉綠素與葉綠素結(jié)合蛋白相互作用及與對(duì)內(nèi)囊體膜形成的調(diào)控：研究表明葉綠素的消失可以導(dǎo)致類囊體膜的消失，而frxc-突變體在黑暗條件不合成葉綠素，在光照條件下可以合成葉綠素的性質(zhì)為我們研究內(nèi)囊體、光合系統(tǒng)組裝的動(dòng)態(tài)性質(zhì)、以及葉綠素與葉綠素結(jié)合蛋白相互作用提供了很好的系統(tǒng)。cfrxc-突變體在黑暗條件長期培養(yǎng)，藍(lán)藻的葉綠素含量很低，這可能給藍(lán)藻的熱模擬降解產(chǎn)物帶來差異。由于其它大分子的合成未受影響，與正常藍(lán)藻比較就可以發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻熱模擬降解產(chǎn)物中那些組份來源于葉綠素。這可能給出對(duì)于重要的標(biāo)志物分子的前體母質(zhì)來源信息。d紅藻與藍(lán)藻藻膽體中含有一類捕光色素復(fù)合蛋白－藻膽蛋白。frxc-突變體在黑暗條件合成葉綠素受阻，可能對(duì)藻膽蛋白的代謝產(chǎn)生影響。并且類囊體膜的解體也使得藻膽體的定位與裝配發(fā)生改變。efrxc-突變抑制了將原葉綠素酸酯轉(zhuǎn)化為葉綠素的原葉綠素酸酯還原酶活性，必然造成上游的原葉綠素酸酯的積累，以及其它上游物質(zhì)的積累，通過光控開關(guān)，研究葉綠素代謝途徑。f.用cDNA差式顯示或基因芯片技術(shù)對(duì)于有光條件下以及暗條件下，正常以及frxc-突變體基因表達(dá)譜進(jìn)行分析，通過比較找出受frxc調(diào)控的基因（即位于frxc下游的基因），并且分析frxc是否參與了光途徑下葉綠素的合成。13)利用已獲得蛋白克隆其基因答：首先根據(jù)研究工作的目的和性狀的生理生化特性，分離純化所需蛋白質(zhì)和多肽，并對(duì)它進(jìn)行部分氨基酸序列分析或制備單克隆抗體。PCR擴(kuò)增。根據(jù)所得的氨基酸序列推出可能的核苷酸序列，人工合成兩個(gè)簡(jiǎn)并的核苷酸引物，以染色體DNA或第一鏈cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，從而得到目的基因片段。構(gòu)建cDNA文庫。對(duì)于組織中含量豐富的基因：根據(jù)基因表達(dá)部位或特異性選取一定的組織提取總RNA，制備poly（A）RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄酶作用合成第一鏈cDNA，并以此為模板，在DNA聚合酶的作用下合成第二鏈cDNA。然后選擇合適的載體構(gòu)建cDNA文庫。根據(jù)所推測(cè)的核苷酸序列合成探針，進(jìn)行菌落或菌斑原位雜交，篩選重組克隆，并進(jìn)行序列測(cè)定。構(gòu)建基因組文庫。用內(nèi)切酶將高相對(duì)分子量的染色體DNA部分消化，并選擇合適的載體(如噬菌體或cosmid載體建立基因組文庫)，然后用人工合成的寡聚核苷酸或以其cDNA克隆等同源性片段為探針篩選目的基因克隆，也可以利用所制備的抗體通過放射性篩選分離目的基因克隆。14)什么叫生物芯片，其最大特點(diǎn)生物芯片指能對(duì)生物分子進(jìn)行快速并行處理和分析的指甲蓋大小的薄型固體器件。（實(shí)際上也可以作化學(xué)分子分析）與電子芯片比：在材料、制作工藝、輸出信號(hào)、使復(fù)雜的系統(tǒng)變小方面相同；但是前者輸入的是液體生物材料，一次性使用；后者可永久使用，輸入為電信號(hào)。15)生化實(shí)驗(yàn)的常規(guī)步驟，將三個(gè)步驟集成起來有什么好處常規(guī)步驟：樣品制備（collection、storage、classification）、生物化學(xué)反應(yīng)、結(jié)果檢測(cè)。優(yōu)點(diǎn)：提高分析速度、降低樣品和試劑的消耗量、使實(shí)驗(yàn)室微型化、提高了檢測(cè)精度、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的數(shù)字化便于應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)(16)如何開展PHA大規(guī)模生產(chǎn)答：創(chuàng)業(yè)之路：(1)市場(chǎng)調(diào)查與預(yù)測(cè)、文獻(xiàn)調(diào)研：分析開發(fā)產(chǎn)品的前景、評(píng)估從實(shí)驗(yàn)室工作轉(zhuǎn)化為工業(yè)大生產(chǎn)的周期、以及市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力，以決定工作方向。(2)成本評(píng)估，項(xiàng)目的規(guī)劃：總投資綱要（固定資本、直接成本(土地、建筑物、保障等)、簡(jiǎn)介成本(工程、建筑、意外、酬金)、啟動(dòng)資金、營運(yùn)資金）(3)尋找合作伙伴：技術(shù)、資金、人力、硬件支持。(4)組織攻關(guān)團(tuán)隊(duì)，設(shè)計(jì)研究技劃：實(shí)驗(yàn)室工作－>工業(yè)化(5)實(shí)驗(yàn)室工作：①菌種篩選②搖瓶實(shí)驗(yàn)(優(yōu)化細(xì)胞生長和產(chǎn)物生產(chǎn)的條件，主要條件有：aPH值；b.溫度；c.溶氧；d.底物選擇：最大和最優(yōu)底物濃度e.其他條件：如限氮、限磷對(duì)于發(fā)酵結(jié)果的影響等等。為進(jìn)一步放大，直至工業(yè)化提供依據(jù)。)③實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的發(fā)酵(5-10L發(fā)酵罐)：發(fā)酵流程的選取Batch（一批）process；Fed-batchprocess；Continuouspr