化學品 亞慢性吸入毒性試驗方法 征求意見稿

4GB/T21786—XXXX化學品亞慢性吸入毒性試驗方法本文件規(guī)定了嚙齒類動物亞慢性吸入毒性試驗的范圍、術(shù)語和定義、試驗基本原則、試驗方法、試驗數(shù)據(jù)和報告。本文件適用于檢測化學品（包括納米材料）的亞慢性吸入毒性。2規(guī)范性引用文件本文件沒有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語、定義和縮略語下列術(shù)語、定義和縮略語適用于本文件。3.1亞慢性吸入毒性subcbronicinhalationtoxicity在試驗動物壽命的一部分期間內(nèi)（不超過壽命的10%試驗動物每天重復(fù)吸入受試物所發(fā)生的有害效應(yīng)。4試驗原則在試驗確定的時間內(nèi)，不同實驗動物組每天吸入一定梯度的受試物，每組一個濃度，連續(xù)染毒90d。為制備動物吸入空氣中合適濃度的受試物而使用賦形劑，時需設(shè)賦形劑對照組。染毒期間每天觀察動物的毒性效應(yīng)。試驗期間死亡和試驗結(jié)束時處死的存活動物均作大體解剖檢查。5試驗方法5.1受試樣品5.1.1氣體或揮發(fā)性化學物、氣溶膠／顆粒性物質(zhì)（包括納米材料5.1.2名稱和識別碼；5.1.3受試物的純度（雜質(zhì)和含量5.1.4液態(tài)物：飽和蒸氣壓、沸點；5.1.5氣溶膠／顆粒物：粒度、形狀和密度分布、肺部的滯留和動力學方面信息；5.1.6閃點；5.1.7爆炸性；5.1.8任何體外或體內(nèi)毒性試驗的結(jié)果；5GB/T21786—XXXX5.1.9預(yù)期用途和人類接觸的可能性；5.1.10如果是混合物，提供配方的分析濃度；5.2試驗準備5.2.1健康成年動物至少飼養(yǎng)5d，以使其適應(yīng)試驗環(huán)境，在試驗前，將動物隨機分組；5.2.2如有必要，可在受試物中加入適合的賦形劑，以助受試物在空氣中形成適宜的濃度，但應(yīng)證實賦形劑不影響受試物的吸收，也不產(chǎn)生毒性反應(yīng)。5.3實驗動物和飼養(yǎng)環(huán)境5.3.1動物的選擇采用常用品系的健康成年哺乳動物。首選的物種是大鼠。如果使用其他物種，應(yīng)進行說明。隨機化分組時，實驗動物應(yīng)該是7至9周齡的成年鼠。動物的體重差異不得超過同性別平均體重的20%。每只動物都要做好標記，以方便識別，并在試驗開始前至少在籠中飼養(yǎng)5天，以便適應(yīng)實驗室環(huán)境。5.3.2飼養(yǎng)環(huán)境試驗動物實驗室的溫度應(yīng)為22℃士3℃,相對應(yīng)濕度為30%~70%。人工光照時，應(yīng)12h明，12h暗。飼以實驗室的常規(guī)飼料，飲水不限；動物按性別單籠飼養(yǎng)，也可群養(yǎng)，但每籠的動物數(shù)以不影響對每只動物的觀察為宜。當使用口鼻方式染毒時，約束管不應(yīng)給動物帶來不必要的物理、熱或固定的壓力。應(yīng)用全身暴露方式染毒時，暴露期間可單獨飼養(yǎng)，以防止它們通過籠中同伴的皮毛再次暴露于受試物。除暴露期間外，試驗動物給予常規(guī)飼料和飲水。5.3.3數(shù)量和性別每一濃度組至少應(yīng)有20只動物（雌雄各半）。雌性應(yīng)為未妊娠和未分娩的動物。如試驗設(shè)計中包括定期處死動物，需按要求增加動物數(shù)。另外，如果設(shè)置恢復(fù)組(20只動物，雌雄各半該組以高濃度染毒90d，在染毒結(jié)束后的觀察期一般不少于28d，用以觀察毒性效應(yīng)的可逆性、持久性以及有無遲發(fā)毒性效應(yīng)。5.3.4氣體染毒設(shè)施亞慢性吸入毒性研究總是在動態(tài)染毒設(shè)施中進行。不能使用靜態(tài)染毒柜。選擇染毒方式的依據(jù)是測試化學品的性質(zhì)和測試的目的。對于液體或固體氣溶膠的研究以及可能凝結(jié)成氣溶膠的蒸汽的研究，首選的接觸方式是口鼻式（單純鼻子或口鼻子）。有特殊目前的試驗可應(yīng)用全身暴露模式染毒，并將染毒方式在研究報告中說明理由。在全身暴露染毒時，為確保染毒柜中氣體相對穩(wěn)定，試驗動物的總體積不應(yīng)超過染毒柜容積的5%。5.4染毒濃度的設(shè)計5.4.1限定濃度測試的最大濃度應(yīng)考慮：1）可達到的最大濃度，2）需要保持足夠的氧氣供應(yīng)，3）動物福利因素。如果沒有數(shù)據(jù)可參考，可使用聯(lián)合國全球化學品統(tǒng)一分類和標簽制度的急性限值（即氣溶膠的最大濃度為5mg/L，蒸汽為20mg/L，氣體為20000ppm）。如果在測試氣體或高揮發(fā)性測試化學品（如制冷劑）時有必要超過這些限制，應(yīng)提供理由。對于顆粒物，只有在能夠保持/達到可吸入顆粒大小的情況下，6GB/T21786—XXXX可進行>2mg/L的氣溶膠的測試。5.4.2劑量范圍研究如果沒有足夠的信息進行劑量設(shè)計，就應(yīng)該進行劑量范圍研究。雖然范圍探索研究的主要目的是為研究選擇濃度水平提供信息，但它也可以提供受試物的其他信息，以確保主體研究的順利進行，尤其是在測試溶解性差的固體氣溶膠時，這一點尤其重要。劑量范圍研究可以提供受試物顆粒大小分布、系統(tǒng)毒性、毒物動力學、測試化學品在肺部的溶解度、顆粒的轉(zhuǎn)移、毒作用機制、臨床病理學（即血液學/臨床化學）、組織病理學、肺損傷的生物標志物、性別敏感性、BALF數(shù)據(jù)，以及主要研究中可能的為觀察到有害作用的濃度(NOAEC)、觀測到有害作用的最低濃度(LOAEC)、最大耐受濃度(MTC)和/或基準劑量（BMC）的估計。研究人員可利用濃度范圍研究來確定在不對動物造成過度應(yīng)激狀況下可以容忍的最高濃度，以及最能體現(xiàn)試驗化學品毒性的參數(shù)。BAL可以在濃度范圍研究終止時進行，也可以在暴露后階段定期進行。當測試固體氣溶膠時，可以對測試化學品的溶解度和暴露后的肺部負擔進行評估，以期為吸入研究的持續(xù)時間和暴露后觀察（PEO）時間點的間隔提供信息。另外，LALN負擔的測量可以提供關(guān)于受試物在肺部轉(zhuǎn)移的信息。濃度范圍研究試驗可能包括受試化學品一個或多個濃度水平和一個對照組。根據(jù)所選擇的終點，每個濃度組的動物不超過5只雄性和5只雌性。染毒時間至少持續(xù)5天，一般不超過28天。如果還包括停止暴露后的時間點觀察，動物數(shù)量應(yīng)作相應(yīng)調(diào)整。當測試溶解性差的顆粒狀化學品時，染毒時間可超過28天，以便尋找染毒劑量范圍；同時也可對測試化學品的溶解性和肺部負擔進行評估。在研究報告中應(yīng)提供正式試驗的濃度選擇的根據(jù)。5.4.3染毒方案每次試驗至少應(yīng)有3個受試物濃度組和1個對照組，使用賦形劑時還應(yīng)設(shè)賦形劑對照組。對照組動物除不給受試物外，其他處理均應(yīng)與染毒組相同。最高濃度組應(yīng)引起毒性效應(yīng)，但不引起動物死亡，以免影響對結(jié)果的評價，最低濃度組不能出現(xiàn)任何毒性效應(yīng)，但濃度應(yīng)超過人類預(yù)期接觸濃度。理想的中間濃度組應(yīng)引起動物輕微的可觀察到毒性效應(yīng)。假如設(shè)計了一個以上的中間濃度，則應(yīng)設(shè)立適當?shù)臐舛忍荻?，以產(chǎn)生不同程度的毒性效應(yīng)。低、中濃度組和對照組的動物死亡發(fā)生率應(yīng)很低，以便對試驗結(jié)果作出有意義的評價。若受試物具有潛在的爆炸性應(yīng)小心，避免達到爆炸的濃度。5.5染毒設(shè)施、環(huán)境和受試樣品濃度檢測動物應(yīng)在吸入染毒設(shè)備中進行試驗。對設(shè)備設(shè)計基本要求：維持每小時12次～15次換氣，保證氧氣體積分數(shù)為19％、受試物在空氣中為均勻分布。如果設(shè)備是染毒柜，除了上述要求外要保證動物在柜內(nèi)不擁擠、并能最大程度的接觸空氣中的受試物?？傊_保染毒柜中氣流的穩(wěn)定，試驗動物的“總體積“不能超過染毒柜容積的5%。如采用口鼻式或頭部暴露吸入染毒法，可避免經(jīng)口和皮膚途徑接觸受試物。應(yīng)使用配有控制測定空氣中受試物濃度的動式吸入染毒系統(tǒng)。通過調(diào)整空氣流速使整個設(shè)備的濃度分布等基本相同。染毒設(shè)備應(yīng)維持輕微的負壓，以免受試物從染毒柜逸出。在試驗過程中應(yīng)進行測量：a)氣流速度，最好連續(xù)監(jiān)測；b)在染毒期間，應(yīng)盡可能地使受試物的實際濃度維持恒定；c)在染毒空氣發(fā)生期間應(yīng)進行粒度分析，對氣溶膠濃度的穩(wěn)定性做出估測（空氣動力學直徑（MMAD）7GB/T21786—XXXX≤2μm，幾何標準偏差(σg或GSD）為1-3在染毒期間，需盡可能多的采樣進行粒度分析，以測定粒度分布的一致性；d)最好連續(xù)監(jiān)測溫度和濕度。5.6染毒步驟5.6.1整體設(shè)計根據(jù)試驗化學品的性質(zhì)可選擇方案A或者方案B，具體見附件。方案A主要用于氣體、蒸汽、液體氣溶膠和可溶性氣體氣溶膠的化合物；方案B用于測試溶解性差的固體氣溶膠，這些化學品有可能停留在肺部。雖然附件中方案A和B對組別設(shè)計、測試的物質(zhì)進行詳細說明，但研究的實際設(shè)計方案由研究負責人來確定，可根據(jù)劑量范圍研究的信息和所有其他可用的相關(guān)數(shù)據(jù)進行研究設(shè)計和選擇暴露濃度。以受試物染毒動物一般每周暴露5d，但也可每周暴露7d每天6h，為期13周（總研究時間為90d）。每天的吸入接觸時間也可根據(jù)需要確立。為觀察染毒結(jié)束后的毒性效應(yīng)的轉(zhuǎn)歸而設(shè)設(shè)立附加實驗組動物在染毒90d后，不再給任何處理，至少再觀察28d，以檢測毒效應(yīng)的可逆性和持久性。進行試驗時動物呼吸帶的溫度維持在22℃士3℃。相對濕度，除了水性氣溶膠外，應(yīng)最好保持在30%~70%。染毒過程中，要停止供食供水。5.6.2附加組設(shè)計染毒分組時也可設(shè)立附加組，以評估治療后適當時間內(nèi)的恢復(fù)性、持久性、延遲發(fā)生的毒性或肺部負擔。附加組的研究設(shè)計見附件。需要注意的是，試驗負責人可以根據(jù)試驗化學品的物理化學特性和動力學來修改實驗設(shè)計，以獲得最可靠的數(shù)據(jù)。所有附加組與主試驗實驗動物同時接觸受試物，且濃度相同，必要時還應(yīng)設(shè)立空氣或空白對照。附加組的設(shè)計取決于試驗化學品是否是固體氣溶膠，是否有可能導(dǎo)致肺部蓄積。如果試驗化學品可能導(dǎo)致肺部滯留，則吸入試驗按方案B所述進行；否則，吸入研究按方案A所述進行。在方案A中可設(shè)立附加組以評估恢復(fù)情況；方案B規(guī)定附加組的設(shè)計以評估恢復(fù)情況和/或測量肺部負擔。5.7實驗動物觀察在染毒過程中，每天至少要進行一次仔細的臨床觀察，必要時，還要增加觀察次數(shù)，來記錄試驗動物的死亡等狀況，當發(fā)現(xiàn)死亡的動物，應(yīng)及時進行大體解剖檢查，或冷藏后以備檢查；對衰弱或瀕死動物進行隔離或處死，作大體解剖檢查。吸入染毒期間和染毒后都要觀察動物，并在系統(tǒng)地觀察后進行記錄，以保存每只動物的觀察記錄；每天都要觀察所有動物，記錄動物的毒性特征，包括出現(xiàn)的時間、程度、持續(xù)時間；籠旁觀察應(yīng)包括但不限于皮膚和被毛、眼睛和黏膜的變化、呼吸、循環(huán)、自主和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、四肢活動和行為方式等的變化。嚴格規(guī)定觀察程序，避免受試動物由于自殘、組織自溶或遺忘等造成試驗動物的丟失。試驗結(jié)束后，除附加組外，處死所有染毒組中存活的動物。5.8檢測指標5.8.1體重在第一次染毒前（第0天應(yīng)記錄動物個體的體重，此后每周記錄兩次體重（例如，在周五和周一，以證明在無接觸的周末的恢復(fù)情況，或固定時間間隔，以便評估全身毒性在死亡或安樂死的時候也應(yīng)該稱重。如果在前4周內(nèi)沒有明顯的體重影響，剩余時間內(nèi)可以每周測量一次體重。在研究終止時，8GB/T21786—XXXX應(yīng)在處死前稱重，以便計算臟器系數(shù)。5.8.2食物和水的消耗應(yīng)每周測量食物消耗量和飲水的消耗量。如果研究方案包括暴露后不同時間點，應(yīng)繼續(xù)進行食物和水消耗的測量。5.9臨床檢查對所有動物應(yīng)做下列項目的檢查：5.9.1眼部檢查在使用受試化學品之前，應(yīng)對所有動物進行眼底、屈光介質(zhì)、虹膜和結(jié)膜的眼科檢查，并在染毒研究結(jié)束時，對所有高濃度組和對照組進行眼科檢查，使用眼科鏡或同等設(shè)備。如果發(fā)現(xiàn)眼睛有變化，應(yīng)檢查其他組的所有動物，包括附加組。5.9.2實驗結(jié)束時進行血液臨床生化測定。表1列出了所有毒理學研究中通常需要的臨床病理參數(shù)。尿液分析不是常規(guī)要求，但在根據(jù)預(yù)期或觀察到的毒性認為有必要時，可以進行尿液檢測。研究負責人可以選擇評估其他參數(shù)，以便更好地描述試驗化學品的毒性，如：膽堿酯酶、脂質(zhì)、激素、酸堿平衡、高鐵血紅蛋白或海因小體、肌酸激酶、骨髓細胞學、肌鈣蛋白、乳酸脫氫酶、谷氨酸脫氫酶和-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶。表1.標準臨床病理參數(shù)血液學鈉9GB/T21786—XXXX鈣磷5.9.3支氣管肺泡灌洗檢測支氣管肺泡灌洗應(yīng)在暴露后觀察期（postexposureobservationPEO-1,暴露終止后24小時內(nèi)）和暴露后的一個間隔期（PEO-2）進行（見附件，選項A）。當測試低溶解性的氣溶膠時（見附件中的選項B應(yīng)在PEO-1（暴露終止后24小時內(nèi)）對兩個性別的動物都進行支氣管灌洗液（BAL）檢查，如果設(shè)置了恢復(fù)組，則在PEO-2對雌性動物進行BAL檢查。灌洗時一般首選右肺。暴露后的持續(xù)時間和PEO的時間由研究人員根據(jù)劑量范圍研究的結(jié)果和其他可用的相關(guān)信息決定。強制性BALF分析指標包括：?1）乳酸脫氫酶（LDH2）總蛋白或白蛋白；3）肺泡巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和嗜酸性粒細胞的細胞計數(shù)和差值。5.9.4肺臟負荷在測試溶解性差的固體氣溶膠時，對肺負荷的測量可以提供受試物殘留狀況。當劑量范圍研究或其他相關(guān)資料顯示試驗化學品已經(jīng)或可能殘留在肺內(nèi)，并且有相應(yīng)的分析方法時，應(yīng)進行肺臟負荷測量。使用雄性進行肺臟負荷策略是因為它比雌性每分鐘呼出氣體量更高，因此可能有更大的肺臟負擔。如附件(選項B)所示，每個濃度組中要增加5個雄性動物。PEO-1計劃在染毒終止后約24小時進行，以便通過粘液纖毛運輸從傳導(dǎo)氣道快速清除沉積的受試化學品。研究人員可選擇在PEO-2和PEO-3組中測量肺負荷。為了獲得關(guān)于肺部清除動力學的信息，應(yīng)在暴露后的所有時間點測量同一肺部（建議使用右肺）的肺部負擔。暴露后的持續(xù)時間和PEO的間隔由研究人員根據(jù)范圍研究的結(jié)果和其他相關(guān)信息來決定。5.9.5病理學檢查所有的試驗動物，包括在試驗過程中死亡的動物；因動物倫理等原因要安樂死的動物，都應(yīng)進行徹底的放血（如果可行的話）和大體的尸檢。如果發(fā)現(xiàn)動物尸體后不能立即進行尸檢，則應(yīng)將動物冷藏(而不是冷凍)到足夠低的溫度，以減少自溶。尸體解剖應(yīng)盡快進行，通常在一兩天內(nèi)完成。應(yīng)記錄每只動物的所有大體病理變化，特別注意呼吸道的任何變化。為避免兔肝、腎、腎上腺和睪丸失水干燥，分離后應(yīng)盡快稱其濕重。表2列出了組織病理學檢查大體剖檢時應(yīng)保存在適當介質(zhì)中的器官和組織。GB/T21786—XXXX表2.尸檢時保存的器官和組織來自肺部肝區(qū)的淋巴結(jié)，特別是對于溶解性差的顆為重點的研究，可以考慮額外的引流淋巴結(jié)，例如來自后縱隔、內(nèi)頸、副頸、后頸、耳廓和/或頸/下胃氣管（至少2個層次，包括1個通過頸部的縱切面GB/T21786—XXXX濕潤稱重，以避免干燥。組織和器官應(yīng)在尸檢后立即用10%緩沖福爾馬林或其他合適的固定劑固定，根據(jù)使用的固定劑至少應(yīng)檢查4個水平的鼻咽組織，其中一個應(yīng)包括鼻咽管，以便充分檢查鱗狀上皮、過渡性（非纖毛性呼吸道）、呼吸性（纖毛性呼吸道）和嗅覺上皮，以及回流淋巴組織（NALT）。喉部的檢測至少包括會厭的底部[14]。氣管檢測應(yīng)該包括一個通過肺外支氣管分叉處的縱切面和一個橫切面。當設(shè)有附加組時，應(yīng)對其他試驗組確證有毒性的組織和器官進行組織病理學檢查。至少在給藥和恢復(fù)階段結(jié)束時，應(yīng)對所有暴露和對照動物在暴露期和暴露后以及動物處死時進行臨床病理學評估。肺部功能如果負責人在盡量范圍研究中發(fā)現(xiàn)嚙齒類動物有反射性呼吸困難的證據(jù)，或其他信息（如低溫）表明可能發(fā)生這些病理反射，應(yīng)該定期測量肺功能和體溫進行量化6試驗數(shù)據(jù)和報告應(yīng)提供劑量范圍研究和主要染毒研究的動物個體數(shù)據(jù)，包括體重、食物消耗、臨床病理、BALF分析、大體病理、器官重量、肺部負擔（如果有）和組織病理學。臨床觀察數(shù)據(jù)應(yīng)以表格形式總結(jié)，顯示每個試驗組使用的動物數(shù)量、顯示特定毒性癥狀的動物數(shù)量、試驗期間發(fā)現(xiàn)死亡或因人道原因被殺死的動物數(shù)量、個別動物的死亡時間、毒性效應(yīng)和可逆性的描述和時間過程，以及尸檢結(jié)果。并進行統(tǒng)計分析。6.1結(jié)果處理將所有數(shù)據(jù)綜合并建議用表格形式表述，結(jié)果中應(yīng)該包括每組試驗開始時各組的動物數(shù)、出現(xiàn)損害的動物數(shù)、損害類型及每種類型的動物百分數(shù)。所有觀察到的結(jié)果，無論定性的還是發(fā)生率，都應(yīng)以適當?shù)慕y(tǒng)計與評價，建議在設(shè)計實驗時選好所采用的統(tǒng)計方法。6.2結(jié)果評價亞慢性吸入毒性試驗的研究結(jié)果應(yīng)將出現(xiàn)的毒性反應(yīng)、大體解剖、組織病理學的發(fā)現(xiàn)進行綜合評價，包括受試物的濃度與異常改變的有或無、發(fā)生率和嚴重程度之間的關(guān)系。例如行為表現(xiàn)和臨床異常、肉GB/T21786—XXXX眼所見的損害、確證的靶器官、體重變化、對死亡率的影響以及任何其他特異或非特異的毒性效應(yīng)。合格的亞慢性吸入90d毒性試驗，可提供未觀察到有害作用的劑量水平(NOAEL)的估計值。6.3試驗報告試驗報告包括下列信息：6.3.1試驗條件a)吸入染毒裝置的描述，包括設(shè)計、類型、容積、空氣來源、微粒和氣溶膠的發(fā)生系統(tǒng)、調(diào)節(jié)空氣的方法、排出廢氣的處理和動物在染毒時的放置方法。b)描述測量溫度、濕度、微粒／氣溶膠及其粒度的設(shè)備。6.3.2染毒資料染毒資料要列成表格，并用平均值和測量變異（標準差）來表示。應(yīng)包括：a)通過吸入裝置的氣流速度；b)空氣的溫度、濕度；c)標識濃度（送入吸入裝置的受試物總量除以空氣的體積d)試驗動物呼吸帶區(qū)中的實際濃度；e)粒度分布（微粒的空氣動力學直徑中值及其標準值）。6.3.3動物資