實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用

實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(RealtimeQuantitativePCR)

2024/12/51提綱：

實(shí)時熒光定量PCR原理

數(shù)學(xué)原理化學(xué)原理實(shí)時熒光定量PCR的方法應(yīng)用絕對定量相對定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素平臺定量PCR儀器介紹2024/12/52實(shí)時熒光定量PCR定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，對起始模板進(jìn)行定量分析的方法。2024/12/53

與普通PCR的區(qū)別

普通PCR技術(shù)：在PCR結(jié)束后對終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時定量PCR技術(shù)：實(shí)時檢測PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指數(shù)期對起始模板進(jìn)行定量。2024/12/542024/12/552024/12/562024/12/57熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是基線（背景）熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。2024/12/582024/12/59

定量PCR的數(shù)學(xué)原理

2024/12/5102024/12/511

斜率與擴(kuò)增效率2024/12/5122024/12/513

熒光定量PCR化學(xué)原理

非特異性熒光標(biāo)記：

1、SYBRGreen

特異性熒光標(biāo)記：

2、TaqMan2024/12/5141、SYBRGreen法2024/12/515SYBRGreen熔解曲線分析

2024/12/516SYBRGreen法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA

使用方便--不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜2024/12/5172、TaqMan探針法

2024/12/518TaqMan作用機(jī)理

2024/12/519么么么么方面Sds絕對是假的20么么么么方面Sds絕對是假的

TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)

2024/12/522Real-timePCR方法應(yīng)用2024/12/523?絕對定量(AbsoluteQuantification，AQ)

病原體檢測轉(zhuǎn)基因食品檢測基因表達(dá)研究?相對定量(RelativeQuantification，RQ)

基因在不同組織中的表達(dá)差異藥物療效考核耐藥性研究2024/12/524

絕對定量與相對定量的定義

2024/12/525絕對定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品：已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：?含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒?含有和待測樣品相同擴(kuò)增片段的cDNA?PCR的產(chǎn)物2024/12/526絕對定量：從熒光到拷貝數(shù)

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相對定量通過內(nèi)標(biāo)定量

內(nèi)標(biāo)（EndogenousControl）通常是β-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量2024/12/528

相對定量：參照因子Calibrator

2024/12/529

相對定量分析方法1-ΔΔCt

前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)

1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：

ΔCT（test)=CT（target,test)-CT（ref,test)ΔCT（calibrator)=CT（target,calibrator)-CT（ref,calibrator)2、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗(yàn)樣本的ΔCT值：

ΔΔCT=ΔCT（test)-ΔCT（calibrator)3、計(jì)算表達(dá)水平比率：

2–ΔΔCT=表達(dá)量的比值2024/12/530

相對定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法

目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同

待測樣品目的基因濃度

待測樣品內(nèi)參基因濃度

F=

對照樣品目的基因濃度對照樣品內(nèi)參基因濃度2024/12/531

定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素2024/12/532

樣品

●DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6~2.0之間●DNA用量：0.05ng–100ng●RNA純度：OD260/OD280=2.0●cDNA用量：1-100ng總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1uL2024/12/533

標(biāo)準(zhǔn)品

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標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法

2024/12/535復(fù)管測試●樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)●重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求2024/12/536平臺PCR儀介紹ABI7500fast特征：使用96孔板，樣品量大，儀器穩(wěn)定，結(jié)果分析直觀ABI試劑ROX校正物理方面的誤差：槍的誤差（如試劑體積）、耗材質(zhì)量（如管蓋厚度、透光性能不一致）所導(dǎo)致的光能損失、儀器穩(wěn)定性（如孔間、批間溫度的波動）Rn=Normalization=Reporter/Referenc2024/12/537Rotorgene6500HRM特征：36孔(普通透明0.2mlPCR