化學(xué)品 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法 征求意見(jiàn)稿

4GB/T21786—XXXX化學(xué)品細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)方法本文件規(guī)定了化學(xué)品回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的范圍、術(shù)語(yǔ)和定義、試驗(yàn)基本原則、試驗(yàn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)本文件適用于檢測(cè)化學(xué)品（有殺菌作用的除外）的致突變性。2規(guī)范性引用文件本文件沒(méi)有規(guī)范性引用文件。3術(shù)語(yǔ)和定義下列定義和術(shù)語(yǔ)適用于本文件。3.1回復(fù)突變?cè)囼?yàn)reversemutationtest在鼠傷寒沙門(mén)氏菌（Salmonellatyphimurium）或大腸桿菌（Escherichiacoli）中檢測(cè)需要氨基酸菌株的突變（分別為組氨酸和色氨酸），以產(chǎn)生一株不依賴外界提供氨基酸的菌株。3.2堿基對(duì)置換突變劑basepairsubstitutionmutagens能夠引起DNA堿基改變的物質(zhì)。在回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中，這種改變可發(fā)生在細(xì)菌基因組的原發(fā)突變位點(diǎn)或第二個(gè)突變位點(diǎn)。3.3移碼突變劑frameshiftmutagens能夠引起DNA中一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)增加或缺失，從而改變RNA讀碼框的物質(zhì)。4試驗(yàn)基本原則4.1細(xì)菌懸液分別在加入或不加入外源性代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試物接觸。在平板摻入法中，將上述混合液與頂層瓊脂混合，再立即倒入基本培養(yǎng)基（底層瓊脂平板/最低營(yíng)養(yǎng)瓊脂）上。在預(yù)孵育法中，先將細(xì)菌懸液與受試物混合進(jìn)行預(yù)孵育，然后與頂層瓊脂混合，再立即倒入基本培養(yǎng)基上。上述平板培養(yǎng)2d～3d后，計(jì)數(shù)回復(fù)突變菌落數(shù)，并與溶劑對(duì)照組的自發(fā)回復(fù)菌落數(shù)進(jìn)行比較。4.2細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)有數(shù)種操作方法，其中最常用的是平板摻入法、預(yù)孵育法、振蕩培養(yǎng)法和懸浮培養(yǎng)法。還有用于檢測(cè)氣體或蒸汽的改良方法。5GB/T21786—XXXX4.3本文件所描述的主要是平板摻入法和預(yù)孵育法。這兩種方法在加入或不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下都能進(jìn)行。有些化合物用預(yù)孵育法更有效，包括短鏈脂肪族亞硝胺、二價(jià)金屬、醛類、偶氮染料和重氮化合物、吡咯里西啶生物堿、烯丙基化合物和硝基化合物。已發(fā)現(xiàn)某些類別的化學(xué)品，用標(biāo)準(zhǔn)的方法并非總能檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果，如平板摻入法和預(yù)孵育法。這種情況應(yīng)視作“特例”，強(qiáng)烈建議采用替代方法進(jìn)行檢測(cè)。文獻(xiàn)中，已用替代方法對(duì)下列“特例”進(jìn)行了鑒定（同時(shí)提供了所用試驗(yàn)程序的示例）?！疤乩币话惆ㄅ嫉玖虾椭氐衔铩怏w和揮發(fā)性化學(xué)物以及糖苷類。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)方法的改動(dòng)應(yīng)有科學(xué)依據(jù)。5試驗(yàn)方法5.1試驗(yàn)準(zhǔn)備5.1.1細(xì)菌5.1.1.1新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)物應(yīng)培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期晚期或穩(wěn)定期早期（濃度約為109個(gè)/ml）,不能使用穩(wěn)定期晚期的培養(yǎng)物。試驗(yàn)中所用的培養(yǎng)物中的活菌滴度應(yīng)較高?；罹味瓤赏ㄟ^(guò)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線的歷史對(duì)照數(shù)據(jù)確定，或每次試驗(yàn)時(shí)通過(guò)平板法測(cè)定活菌數(shù)量。5.1.1.2推薦的培養(yǎng)溫度為37℃。5.1.1.3至少應(yīng)使用5種菌株，包括4株鼠傷寒沙門(mén)氏菌（TA1535；TA1537或TA97a或TA97；TA98和TA100這些菌株在不同實(shí)驗(yàn)室之間的檢測(cè)結(jié)果可靠且具有重復(fù)性。這4種菌株在初始回復(fù)突變位點(diǎn)有GC堿基對(duì)，已知它們可能無(wú)法檢測(cè)某些氧化型致突變物、交聯(lián)劑和肼類。檢測(cè)這些物質(zhì)應(yīng)選用在初始回復(fù)突變位點(diǎn)有AT堿基對(duì)的大腸桿菌WP2菌株或鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102菌株。因此，推薦的菌株組合方案如下：鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1515和鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1537或TA97或TA97a和鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA98和鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA100和大腸桿菌WP2uvrA或大腸桿菌WP2uvrA（pKM101）或鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102為檢測(cè)交聯(lián)誘變劑，最好選用鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA102或一種擅長(zhǎng)修復(fù)DNA的大腸桿菌，如大腸桿菌WP2或大腸桿菌WP2（pKM101）作為受試菌株之一。5.1.1.4應(yīng)按已建立的操作規(guī)程進(jìn)行菌種的培養(yǎng)制備、標(biāo)記鑒別和保存。每次復(fù)蘇凍存菌種的培養(yǎng)制品時(shí)，均應(yīng)進(jìn)行氨基酸需求試驗(yàn)（鼠傷寒沙門(mén)氏菌需要組氨酸，大腸桿菌需要色氨酸）。同樣，還應(yīng)進(jìn)行其它的表型鑒定，包括有無(wú)R因子質(zhì)粒[即TA98，TA100和TA97a或TA97，WP2uvrA和WP2uvrA（pKM101）菌株對(duì)氨芐青霉素的抗性，以及TA102菌株對(duì)氨芐青霉素和四環(huán)素的抗性]和特征性突變的存在（如鼠傷寒沙門(mén)氏菌的rfa突變使其對(duì)結(jié)晶紫敏感，大腸桿菌的uvrA突變和鼠傷寒沙門(mén)氏菌的uvrB突變使其對(duì)紫外線敏感）。這些菌株會(huì)產(chǎn)生自發(fā)回變，通過(guò)平板計(jì)數(shù)獲得的自發(fā)回變數(shù)應(yīng)在實(shí)驗(yàn)室歷史對(duì)照數(shù)據(jù)范圍內(nèi)，最好在文獻(xiàn)報(bào)道的范圍內(nèi)。5.1.2培養(yǎng)基應(yīng)用適宜的基本培養(yǎng)基（含Vogel-Bonner基本培養(yǎng)基E和葡萄糖）和含有組氨酸和生物素或色氨酸的頂層瓊脂，以供細(xì)菌完成少量細(xì)胞分裂。5.1.3代謝活化6GB/T21786—XXXX細(xì)菌應(yīng)在有或無(wú)適量代謝活化系統(tǒng)的條件下與受試物接觸。最常用的活化系統(tǒng)是經(jīng)酶誘導(dǎo)劑處理的，從嚙齒類動(dòng)物肝制備的加輔助因子的后線粒體組分（S9）。所用的酶誘導(dǎo)劑包括Aroclor1254或苯巴比妥和?-萘黃酮聯(lián)合處理。常用的后線粒體組分濃度范圍是S9混合液的5%～30%（體積分?jǐn)?shù)）。應(yīng)根據(jù)受試物的類別選擇代謝活化系統(tǒng)及其應(yīng)用條件。在某些情況下，適用于使用一種以上濃度的S9。對(duì)于偶氮染料或重氮化合物，應(yīng)選擇還原性代謝活化系統(tǒng)。5.1.4受試物/準(zhǔn)備在對(duì)菌株進(jìn)行處理前，固體受試物應(yīng)溶解或混懸于合適的溶劑或賦形劑中，如需要可適度稀釋。液體受試物可直接加入測(cè)定體系或在處理前適度稀釋。受試物應(yīng)新鮮制備，除非有資料證明其貯存的穩(wěn)定性。5.2試驗(yàn)條件5.2.1溶劑/賦形劑溶劑/賦形劑不應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，且對(duì)細(xì)菌的存活和S9的活性無(wú)影響。若選用的不是常用的溶劑或賦形劑，應(yīng)有資料提供適合的理由。建議在可能的情況下，首先考慮使用水性溶劑或賦形劑。如受試物對(duì)水不穩(wěn)定，應(yīng)選用不含水的有機(jī)溶劑。5.2.2染毒劑量5.2.2.1應(yīng)根據(jù)受試物對(duì)細(xì)菌的毒性和在配制的最終混合物中的溶解度確定受試物所用的最高濃度。建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定受試物的毒性和溶解度。可將回復(fù)突變菌落數(shù)目減少、背景菌苔減少或消失，或處理后的細(xì)菌存活程度等作為細(xì)胞毒性的指征。代謝活化系統(tǒng)的存在可能改變受試物的毒性。在實(shí)際試驗(yàn)條件下，最終混合物出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的沉淀即判斷為不溶。對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性的可溶性受試物，建議最高試驗(yàn)劑量為5mg/皿或5μL/皿。對(duì)無(wú)細(xì)胞毒性但溶解度達(dá)不到5mg/皿或5μL/皿的受試物，在最終處理混合物中應(yīng)有一個(gè)或多個(gè)不溶濃度。在低于5mg/皿或5μL/皿時(shí)即出現(xiàn)細(xì)胞毒性的受試物，最高劑量為出現(xiàn)細(xì)胞毒性的劑量。沉淀不應(yīng)影響結(jié)果計(jì)數(shù)。 5.2.2.2在開(kāi)始試驗(yàn)時(shí)，至少應(yīng)選用5個(gè)可供分析的試驗(yàn)劑量，劑量間隔一般為半對(duì)數(shù)（例如10）。在研究劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，也可采用更小的劑量間隔。5.2.2.3如果受試物含有大量可能具有致突變作用的雜質(zhì)，試驗(yàn)濃度可超過(guò)5mg/皿或5μL/皿。5.2.3對(duì)照5.2.3.1每次試驗(yàn)均應(yīng)設(shè)置平行的陽(yáng)性和陰性（溶劑或賦形劑）對(duì)照，且應(yīng)在有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)的條件下分別設(shè)置。應(yīng)選擇能夠證明每次試驗(yàn)有效性的陽(yáng)性對(duì)照物劑量。5.2.3.2對(duì)于采用代謝活化系統(tǒng)的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)菌株類型選擇適宜的陽(yáng)性物。下列化學(xué)品是適合進(jìn)行代謝活化試驗(yàn)的陽(yáng)性物：9,10-二甲基蒽9,10-Dimethylanthracene[CASno.781-43-1]7,12-二甲基苯蒽7,12-Dimethylbenzanthracene[CASno.57-97-6]剛果紅CongoRed[CASno.573-58-0]（用于還原代謝活化法）苯并[a]芘Benzo(a)pyrene[CASNno.50-32-8]環(huán)磷酰胺（一水合物）Cyclophosphamide（monohydrate）[CASno.50-18-0（CASno.6055-19-2）]7GB/T21786—XXXX2-氨基蒽2-Aminoanthracene[CASno.613-13-8]2-氨基蒽不能單獨(dú)作為評(píng)價(jià)S9混合物活性的指示劑，如果選用2-氨基蒽，對(duì)每批S9還應(yīng)另選一種需要微粒體酶代謝活化的致突變物證實(shí)其活性，如苯并[a]芘或二甲基苯蒽。5.2.3.3對(duì)不加代謝活化系統(tǒng)的試驗(yàn)，各菌株特異性的陽(yáng)性對(duì)照物見(jiàn)表1。表1各菌株特異性對(duì)照物表N-乙基-N-硝基-N-亞硝基胍N-Ethyl-N-nitrN-甲基-N-硝基-N-亞硝基胍N-Methyl-N-n5.2.3.4也可使用其它適合的陽(yáng)性物。如可能，可考慮使用化學(xué)類別相關(guān)的陽(yáng)性對(duì)照物。5.2.3.5陰性對(duì)照在每次試驗(yàn)時(shí)除在試驗(yàn)培養(yǎng)基中只加入溶劑或賦形劑外，其余方面應(yīng)與處理組相同。另外，如果沒(méi)有歷史對(duì)照數(shù)據(jù)證明所用溶劑或賦形劑無(wú)毒性作用或致突變作用，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照組（不進(jìn)行任何處理）。5.3試驗(yàn)步驟5.3.1受試物處理5.3.1.1平板滲入法：不需代謝活化時(shí)，通常將0.05mL或0.1mL受試物溶液、0.1mL新鮮的細(xì)菌培養(yǎng)液（約含108個(gè)活細(xì)胞）和0.5mL滅菌緩沖液與2.0mL頂層瓊脂混合。如需代謝活化系統(tǒng)，通常將0.5mL含足量后線粒體組分（體積約占代謝活化混合液總量的5%～30%）的代謝活化混合物與細(xì)菌和受試物/受試溶液一起與頂層瓊脂（2.0mL）混合。將上述混合液充分混合后倒在最低營(yíng)養(yǎng)瓊脂上。待頂層瓊脂凝固后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。5.3.1.2預(yù)孵育法：將受試物/受試溶液與受試菌株（約含108個(gè)活細(xì)胞）和滅菌緩沖液或代謝活化系統(tǒng)（0.5mL）在30℃~37℃預(yù)孵育20min。再與頂層瓊脂混合，然后倒在最低營(yíng)養(yǎng)瓊脂上。通常用0.05mL或0.1mL受試物/受試溶液、0.1mL菌液，0.5mLS9混合物或滅菌緩沖液，與2.0mL頂層瓊脂混合。在預(yù)孵育過(guò)程中，將試管放入搖床振蕩培養(yǎng)以便通氣。5.3.1.3為了充分評(píng)價(jià)結(jié)果的變異度，每個(gè)劑量水平應(yīng)做三個(gè)平行平板。如有科學(xué)的理由也可做兩個(gè)平行平板。偶爾丟失一個(gè)平板的數(shù)據(jù)并不一定使測(cè)試無(wú)效。5.3.1.4氣態(tài)或揮發(fā)性物質(zhì)應(yīng)采用適當(dāng)?shù)姆绞竭M(jìn)行試驗(yàn)，如在密封容器中進(jìn)行。5.3.2培養(yǎng)將試驗(yàn)中的所有平板置于37℃培養(yǎng)48h～72h。培養(yǎng)結(jié)束后，計(jì)數(shù)每個(gè)平板的回復(fù)突變菌落數(shù)。8GB/T21786—XXXX6試驗(yàn)數(shù)據(jù)和報(bào)告6.1數(shù)據(jù)處理6.1.1應(yīng)列出每個(gè)平皿的回復(fù)突變菌落數(shù)。還應(yīng)記錄陰性對(duì)照（溶劑對(duì)照，有時(shí)還有空白對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組各皿的回復(fù)突變菌落數(shù)。6.1.2應(yīng)列出受試物各組、陰性對(duì)照（溶劑對(duì)照/空白對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照每皿的回復(fù)突變菌落數(shù)、平均回復(fù)突變菌落數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差。6.1.3對(duì)明確的陽(yáng)性結(jié)果無(wú)需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。可疑結(jié)果最好通過(guò)改進(jìn)條件進(jìn)一步試驗(yàn)來(lái)明確。陰性結(jié)果需視具體情況而定。如認(rèn)為陰性結(jié)果無(wú)需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，應(yīng)說(shuō)明理由。在隨后的試驗(yàn)中應(yīng)改進(jìn)試驗(yàn)參數(shù)以擴(kuò)大評(píng)價(jià)條件范圍，可改進(jìn)的參數(shù)包括劑量間距、處理方法（平板摻入法或溶液預(yù)孵育等）和代謝活化條件。6.2結(jié)果評(píng)價(jià)和解釋6.2.1陽(yáng)性結(jié)果判定有幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。受試物各組回復(fù)突變菌落數(shù)在試驗(yàn)范圍內(nèi)的增加呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，和/或至少有一個(gè)菌株在有或無(wú)代謝活化系統(tǒng)下，在一個(gè)或多個(gè)劑量下每皿回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)可重復(fù)的增加。應(yīng)首先考慮結(jié)果的生物學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可用于幫助評(píng)價(jià)試驗(yàn)結(jié)果，但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性不能作為陽(yáng)性反應(yīng)判定的唯一因素。6.2.2不符合以上標(biāo)準(zhǔn)的受試物則被認(rèn)為在本試驗(yàn)中無(wú)致突變性。6.2.3雖然大多數(shù)試驗(yàn)都能得出明確的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，但極少數(shù)試驗(yàn)不能對(duì)受試物活性做出明確判斷。無(wú)論重復(fù)試驗(yàn)多少次，結(jié)果仍不明確或可疑。6.2.4細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果表明，受試物可引起鼠傷寒沙門(mén)氏菌和/或大腸桿菌的基因組發(fā)生堿基置換或移碼突變誘發(fā)的點(diǎn)突變。陰性結(jié)果表明在本試驗(yàn)條件下，受試物不引起試驗(yàn)菌株的突變。6.3試驗(yàn)報(bào)告試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包含以下信息：6.3.1受試物a)名稱和識(shí)別碼如CAS編號(hào)（如已知）；b)物理性質(zhì)和純度；c)與試驗(yàn)實(shí)施相關(guān)的物理化學(xué)特性；d)受試物的穩(wěn)定性（如已知）。6.3.2溶劑/賦形劑a)選擇溶劑/賦形劑的理由；b)受試物在溶劑/賦形劑中的溶解度和穩(wěn)定性（如已知）。6.3.3細(xì)菌a)所用菌株；9GB/T21786—XXXXb)每次培養(yǎng)加入的細(xì)菌數(shù)；c)菌株特征。6.3.4試驗(yàn)條件a)每皿加入受試物的量（mg/皿或μg/皿），劑量選擇的依據(jù)，每個(gè)劑量的平皿數(shù)；b)選用的培養(yǎng)基；c)代謝活化系統(tǒng)的類型和成分，包括判斷可接受的標(biāo)準(zhǔn)；d)處理過(guò)程。6.3.5結(jié)果a)