第7章色譜分離技術(shù)

一、色譜分離技術(shù)的概念

色譜（chromatography）分離技術(shù)是一類分離方法的總稱，又稱色譜法、層析法、層離法等。它是利用不同組分在固定相和流動(dòng)相中的物理化學(xué)性質(zhì)的差別，使各組分在兩相中以不同的速率移動(dòng)而進(jìn)一步分離的技術(shù)。第7章色譜分離技術(shù)第一節(jié)概述色譜現(xiàn)象In1903，俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTsweett’sWork(seeBer.Deut.Botan.Ges.,1906;24:384).Chromatography=(chromatus=color,graphein=towrite).圖示固定相——CaCO3顆粒流動(dòng)相——石油醚

色帶一、色譜過(guò)程

色譜柱檢測(cè)器色譜圖

組分在色譜柱內(nèi)運(yùn)動(dòng)溶質(zhì)濃度分布柱內(nèi)：譜帶柱后：色譜峰色譜儀1.定義

色譜是根據(jù)混合物中溶質(zhì)在互不混溶的兩相間分配行為的差別而引起移動(dòng)速度的不同而進(jìn)行分離的方法。2.色譜法的特點(diǎn)分離效率高可選操作參數(shù)多應(yīng)用范圍廣高靈敏度的在線檢測(cè)快速分離與過(guò)程自動(dòng)化操作在色譜過(guò)程中，分配系數(shù)大的溶質(zhì)在固定相上存在的概率大，隨流動(dòng)相移動(dòng)速度小。由此，溶質(zhì)之間由于移動(dòng)速度的不同而得到分離。

色譜操作中互不混溶的兩相分別稱為固定相和流動(dòng)相。固定相填充于柱內(nèi)形成固定床，在柱的入口端加入料液后，連續(xù)輸入流動(dòng)相，料液中溶質(zhì)在流動(dòng)相與固定相之間擴(kuò)散傳質(zhì)，產(chǎn)生分配平衡3.色譜一般過(guò)程在色譜法中，表面積較大的固體或附著在固體上且不運(yùn)動(dòng)的液體，靜止不動(dòng)的一相（稱為固定相

；自上而下運(yùn)動(dòng)的一相（一般是氣體或液體）稱為流動(dòng)相。二、色譜分離系統(tǒng)的組成根據(jù)分離時(shí)一次進(jìn)樣量的多少，色譜分離的規(guī)模可分為色譜分析規(guī)模(小于10mg)、半制備(10~50mg)、制備規(guī)模(0.1~10g)和工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模(>10g)。色譜分離的規(guī)模小，但產(chǎn)值高。三、色譜分離技術(shù)的分類

超臨界流體色譜—流動(dòng)相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體三、色譜法的分類根據(jù)流動(dòng)相的相態(tài)不同:氣相色譜—以氣體作流動(dòng)相液相色譜—以液體作流動(dòng)相—固定相涂敷在玻璃或金屬板上—薄層色譜三、色譜法的分類根據(jù)固定相的附著方式分類

—液體固定相涂在紙上—紙色譜(平板色譜)—固定相裝在圓柱管中—柱色譜三、色譜法的分類吸附色譜法分配色譜法離子交換色譜法凝膠色譜法親和色譜法按分離機(jī)理不同，可分為：三、色譜法的分類根據(jù)操作壓力的不同分類：低壓色譜：操作壓力<0.5MPa中壓色譜：操作壓力0.5～4.0MPa高壓色譜：操作壓力4.0～40MPa

色譜法的缺點(diǎn)是處理量小、操作周期長(zhǎng)、不能連續(xù)操作。四、色譜法的特點(diǎn)(1)分離效果高(2)應(yīng)用范圍廣(3)選擇性強(qiáng)(4)設(shè)備簡(jiǎn)單第二節(jié)

吸附色譜法吸附色譜法(adsorptionchromatography，AC)是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。固體吸附劑，如有較強(qiáng)極性硅膠、中等極性氧化鋁、非極性炭及特殊作用的分子篩等。吸附色譜是靠溶質(zhì)與吸附劑之間的分子吸附力的差異而分離的方法。吸附力主要是范德華力，有時(shí)也可能形成氫鍵或化學(xué)鍵。吸附法的關(guān)鍵是選擇吸附劑和展開劑。1.基本原理吸附色譜分離過(guò)程示意圖

下列三個(gè)化合物用硅膠吸附色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯（95：5）洗脫，判斷三者流出色譜柱先后順序。

ABC由先到后：

C→B→A

舉例：平衡系數(shù)（分配系數(shù)、吸附系數(shù)、選擇性系數(shù)）K=cs/cm

cs—固定相中的濃度；cm—流動(dòng)相中的濃度影響K的因素：被分離物質(zhì)本身的性質(zhì)、固定相和流動(dòng)相的性質(zhì)、色譜柱的操作溫度。各物質(zhì)K差異越大，色譜分離效果越理想。阻滯因數(shù)（比移值）

斑點(diǎn)到原點(diǎn)的距離

Rf值=————————

溶劑前沿到原點(diǎn)距離阻滯因數(shù)①0≤Rf≤1Rf越大，溶質(zhì)隨流動(dòng)相移動(dòng)快，被洗脫速率也就越快。②當(dāng)Rf=1，此種溶質(zhì)不溶于固定相，隨流動(dòng)相以同樣的速率移動(dòng)。③當(dāng)Rf=0，此種溶質(zhì)不溶于流動(dòng)相，而被吸附在固定相上。選用吸附色譜法分離化合物時(shí)，必須首先了解被分離化合物的性質(zhì)，然后選擇合適的吸附劑和展開劑。被分離化合物、吸附劑和展開劑三者關(guān)系配合恰當(dāng)才能得到較好的分離效果。2.吸附劑與展開劑薄層色譜法選擇的主要吸附劑為氧化鋁、硅膠和聚酰胺。色譜用的吸附劑要求一定的形狀與粒度范圍，不同吸附劑用于分離不同類型的化合物。吸附劑還必須具有一定的活度，活度太高或過(guò)低都不能使混合物各組分得到有效的分離。（1）薄層色譜的吸附劑與展開劑展開劑基本原則主要有兩個(gè)：①展開劑對(duì)被分離組分有一定的解吸能力，但又不能太大。②展開劑應(yīng)該對(duì)被分離的物質(zhì)有一定的溶解度。展開劑常用溶劑極性次序?yàn)椋杭和?lt;環(huán)己烷<四氯化碳<甲苯<苯<氯仿<乙醚<乙酸乙酯<丙酮<正丙醇<乙醇<甲醇<水<冰醋酸吸附劑應(yīng)有最大的比表面積和足夠的吸附能力，它對(duì)欲分離的不同物質(zhì)應(yīng)該有不同的解吸能力；與洗脫劑、溶劑及樣品組分不會(huì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；吸附劑顆粒均勻，操作過(guò)程中不會(huì)破裂。（2）柱色譜的吸附劑與洗脫劑吸附劑的選擇洗脫劑的選擇原則上要求所選的洗脫劑純度合格，與樣品和吸附劑不起化學(xué)反應(yīng)，對(duì)樣品的溶解度大，粘度小，容易流動(dòng)，容易與洗脫的組分分開。洗脫劑的選擇常用的洗脫劑有飽和的碳?xì)浠衔?、醇、酚、酮、醚、鹵代烷、有機(jī)酸等。選擇吸附劑時(shí)，可根據(jù)樣品的溶解度、吸附劑的種類、溶劑極性等方面考慮先用極性小的作洗脫劑，然后換用極性大的溶劑作洗脫劑，使組分容易從吸附柱中洗出。3.影響吸附分離的因素①和功能基極性有關(guān)。極性增加的順序：烷烴、不飽和烴、醚、酯、酮、醛、醇、酚和羧酸，同一類化合物極性基團(tuán)越多，極性越大。②小分子的化合物比大分子的化合物極性大。③和某些細(xì)微結(jié)構(gòu)有關(guān)，如氫鍵、異構(gòu)體等。二、吸附色譜分離操作及其設(shè)備1.薄層吸附色譜分離操作及設(shè)備（1）薄層色譜板的制備（2）點(diǎn)樣（3）展開（4）顯色①干法鋪板(軟板制備)

多用于氧化鋁薄層板的制備。在一塊邊緣整齊的玻璃板上，鋪上適量的氧化鋁，取一合適物品頂住玻璃板右端。兩手緊握鋪板玻璃棒的邊緣，按箭頭方向輕輕拉過(guò)，一塊邊緣整齊、薄厚均勻的氧化鋁薄層即成。(1)薄層色譜板的制備干法制板可用于硅膠、聚酰胺、氧化鋁等薄層板的制備，但最常用的是硅膠硬板。為使制成的硅膠板堅(jiān)硬，要加入黏合劑，用硫酸鈣為粘合劑鋪成的板稱為硅膠G板，用羧甲基纖維素鈉作黏合劑鋪成的板為硅膠-CMC板。(2)濕法鋪板(硬板制備)聚酰胺膜多為外購(gòu)商品。2)點(diǎn)樣

用一根玻璃毛細(xì)管或點(diǎn)樣器，吸取樣品溶液，在距薄層一端約2cm的起始線上點(diǎn)樣，每點(diǎn)間距約2cm，樣品點(diǎn)直徑一般小于0.5cm。注意點(diǎn)樣量要適中，太少時(shí)，某些成分不能被檢出；太多時(shí)容易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，即每個(gè)斑點(diǎn)都拉得很長(zhǎng)，互相重疊，不能分開。3）展開展開操作需要在密閉的容器中進(jìn)行。展開劑配好（2～10mL）倒入層析缸。放置一定時(shí)間，待層析缸被展開劑飽和后，再迅速將薄層板放入，密閉，展開即開始，這樣可防止邊緣效應(yīng)產(chǎn)生。薄板放入層析缸時(shí)，切勿使溶劑浸沒(méi)樣品點(diǎn)。當(dāng)溶劑移動(dòng)到接近薄層上端邊緣時(shí)，取出薄板，劃出溶劑前沿。展開方式可分三類：(1)上行展開法最常用

就是使展開劑從下往上爬行展開；(2)單次展開法和多次展開法(3)單向展開法和雙向展開法

薄層板玻璃板上涂吸附劑層SiO2Al2O3上行法薄層板層析缸展開劑層析缸展開劑濾紙條下行法薄層板薄層色譜法(Thin

Layer

Chromatography)4)顯色顯色也稱定位，即用某種方法使經(jīng)色譜展開后的混合物斑點(diǎn)呈現(xiàn)顏色，以便觀察其位置(1)

紫外線照射法(4)

生物顯跡法(2)

噴霧顯色法(3)

碘蒸汽顯色法2.吸附柱色譜分離操作及設(shè)備洗脫液樣品填充物分部收集玻璃柱色譜柱通常用玻璃柱。工業(yè)上用金屬制造。柱入口端應(yīng)該有進(jìn)料分布器，使進(jìn)入柱內(nèi)的流動(dòng)相分布均勻。色譜柱頂端加一層多孔的尼龍圓片或保持一段緩沖液層。柱底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板，最簡(jiǎn)單的也可以用鋪有濾布的橡皮塞。(1)色譜柱的選擇設(shè)計(jì)柱長(zhǎng)時(shí)需考慮下列幾點(diǎn)：(3)柱越長(zhǎng)，長(zhǎng)度和內(nèi)徑比越大，就越難得到均勻的填裝。大多數(shù)色譜柱的長(zhǎng)度25cm左右。(1)柱的最小長(zhǎng)度取決于所要達(dá)到的分離程度(2)較大的柱直徑需要較長(zhǎng)的色譜柱。①干法裝柱在柱下端加少許棉花或玻璃棉，再輕輕地撒上一層5mm厚的干凈砂粒，或放置大小合適的玻璃砂芯。打開下口，然后將吸附劑經(jīng)漏斗緩緩加入柱中，同時(shí)輕輕敲動(dòng)色譜柱，使吸附劑松緊一致將色譜柱用最初洗脫劑小心沿壁加入，至剛好覆蓋吸附劑頂端平面，關(guān)緊下口活塞。(2)裝柱②濕法裝柱吸附劑中加入適量洗脫劑調(diào)成稀糊狀，

再把放好棉花或玻璃砂芯的色譜柱下口打開，然后徐徐將制好的糊漿灌入柱子。操作要慢，不要將氣泡壓入吸附劑中，而且要始終保持吸附劑上有溶劑，最后讓吸附劑自然下沉。當(dāng)洗脫劑剛好覆蓋吸附劑平面時(shí)，關(guān)緊下口活塞。(3)上樣①濕法上樣

把被分離的物質(zhì)溶在少量洗脫劑中，小心加在吸附劑上層，注意保持吸附劑上表面仍為一水平面打開下口，待溶液面正好與吸附劑上表面一致時(shí)，在上面撒一層細(xì)砂，關(guān)緊柱活塞。②干法上樣可選用一種對(duì)樣品溶解度大而且沸點(diǎn)低的溶劑，取盡可能少的溶劑將其溶解。在溶液中加入少量吸附劑，拌勻，揮干溶劑，研磨使之成松散均勻的粉末，輕輕撒在色譜柱吸附劑上面，再撒一層細(xì)砂。(4)洗脫在裝好吸附劑的色譜柱中緩緩加入洗脫劑，進(jìn)行剃度洗脫，各組分先后被洗出。若用50g吸附劑，一般每份洗脫液量常為50mL?，F(xiàn)多采用薄層色譜或紙色譜定性檢查各流分中的化學(xué)成分組成。含單一色點(diǎn)的部分用合適的溶劑結(jié)晶；仍為混合物的部分進(jìn)一步尋找分離方法再進(jìn)行分離。注意：整個(gè)操作過(guò)程必須注意不使吸附柱表面的溶液流干。應(yīng)控制洗脫液的流速。應(yīng)盡量在短時(shí)間內(nèi)完成一個(gè)柱層析的分離。洗脫操作的方式可分為：前沿分析法（迎頭法）：將混合物溶液連續(xù)通過(guò)色譜柱，只有吸附力量最弱的組分最先自柱中流出，其他各組分不能達(dá)到分離。置換展開法（頂替法）：利用一種吸附力比各組分都強(qiáng)的溶劑作為洗脫劑，替代結(jié)合在固定相上的各組分。處理量大，且各組分分層清楚。洗脫展開法（洗脫分析法）：先將混合物盡量濃縮，引入色譜柱上部，然后用溶劑洗脫，使各組分分離完全。應(yīng)用最廣。三、吸附色譜法的應(yīng)用主要用于具有不同官能團(tuán)或具有相同官能團(tuán)但數(shù)目不同的極性化合物及異構(gòu)體等生物小分子物質(zhì)的分離分析。第三節(jié)

凝膠色譜法凝膠色譜是基于分子大小不同而進(jìn)行分離的一種分離技術(shù)，又稱凝膠過(guò)濾、凝膠滲透過(guò)濾、分子篩過(guò)濾、阻滯擴(kuò)散層析或排阻層析。優(yōu)點(diǎn)：操作方便、不會(huì)使物質(zhì)變性、適用于不穩(wěn)定的化合物、凝膠不用再生、可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：分離速度較慢。一、基本原理小分子物質(zhì)可在凝膠顆粒間隙中擴(kuò)散外，還可以進(jìn)入凝膠顆粒的微孔中，如此不斷地進(jìn)入和擴(kuò)散，小分子物質(zhì)的下移速度落后于大分子物質(zhì)，從而使樣品中分子大的先流出色譜柱，中等分子的后流出，分子最小的最后流出，這種現(xiàn)象叫分子篩效應(yīng)。凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖小分子大分子凝膠基質(zhì)凝膠珠二、凝膠過(guò)濾介質(zhì)理想的凝膠過(guò)濾介質(zhì)具有高物理強(qiáng)度及化學(xué)穩(wěn)定性，能夠耐受高溫高壓和強(qiáng)酸強(qiáng)堿，具有高化學(xué)惰性，內(nèi)孔徑分布范圍窄，珠粒顆粒大小均一度高。目前，常用的有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等。1.葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠是應(yīng)用最廣泛的一類凝膠，國(guó)外商品名為Sephadex。它由葡聚糖Dextran交聯(lián)而得。交聯(lián)劑在原料總質(zhì)量中所占的百分?jǐn)?shù)叫交聯(lián)度。交聯(lián)度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越緊密，吸水后體積膨脹越少；反之，交聯(lián)度越小，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越疏松，吸收量越多，吸水后體積膨脹越大。2.瓊脂糖凝膠瓊脂糖凝膠來(lái)源于一種海藻多糖瓊脂，是一種天然凝膠，孔隙度是以改變瓊脂糖濃度而達(dá)到的。瓊脂糖凝膠的化學(xué)穩(wěn)定性不如葡聚糖凝膠。用瓊脂糖凝膠進(jìn)行分離操作的適宜工作條件是在pH為4.5～9，溫度0～40℃。瓊脂糖凝膠對(duì)硼酸鹽有吸附作用，不能用硼酸緩沖液。3.聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成凝膠，其穩(wěn)定性比葡聚糖凝膠好。洗脫時(shí)不會(huì)有凝膠物質(zhì)被洗脫下來(lái)。在pH2~11范圍穩(wěn)定。缺點(diǎn)是不耐酸，遇酸時(shí)酰胺鍵會(huì)水解成羧基，使凝膠帶有一定的離子交換基團(tuán)。三、凝膠過(guò)濾介質(zhì)的選擇1.分離范圍2.分辨率3.穩(wěn)定性四、操作方法1.凝膠的預(yù)處理市售凝膠必須經(jīng)過(guò)充分溶漲后才能使用，如果溶漲不充分，則裝柱后凝膠繼續(xù)溶漲，造成填充層不均勻，影響分離效果。在燒杯中將干燥凝膠加水或緩沖液，攪拌、靜置、傾去上層混懸液、除去過(guò)細(xì)的粒子。如此反復(fù)多次，直至上層澄清為止。2.層析柱的選擇層析柱的體積和高徑比與層析分離效果的關(guān)系相當(dāng)密切。層析柱的直徑大小不影響分離度，樣品用量大，可加大柱的直徑。分離度取決于柱高，為分離不同組分，凝膠柱床必須有適宜的高度。3.凝膠柱的裝填空柱中應(yīng)留1/5的水或溶劑。所用凝膠必須是經(jīng)過(guò)充分溶漲的。開始進(jìn)膠后應(yīng)當(dāng)打開柱端閥門并保持一定流速，太快的流速往往造成凝膠板結(jié)，對(duì)分離不利。進(jìn)膠過(guò)程必須連續(xù)、均勻，不要中斷，并在不斷攪拌下使膠均勻沉降。4.樣品處理和加樣分離蛋白質(zhì)樣品的體積為凝膠床的1-4％一般約0.5-2ml在蛋白質(zhì)溶液除鹽時(shí)，樣品可達(dá)凝膠床的20-30％。分級(jí)分離樣品體積要小，使樣品層盡可能窄，洗脫出的峰形較好。4.樣品處理和加樣加樣時(shí)盡量減少樣品的稀釋及凝膠床面的攪動(dòng)。直接將樣品加到層析床表面5.洗脫與收集為了防止柱床體積的變化，造成流速降低及重復(fù)性下降，整個(gè)洗脫過(guò)程中始終保持一定的操作壓。流速不宜太快且要穩(wěn)定。洗脫液的成分也不應(yīng)改變，以防凝膠顆粒的脹縮引起柱床體積變化或流速改變。6.凝膠的保存(1)干法(2)濕法(3)半縮法第四節(jié)親和色譜親和色譜(affinitychromatography，AFC)利用固定相配基與生物大分子之間的特殊生物親和力的不同實(shí)現(xiàn)分離的。親和色譜廣泛用于酶、抗體、核酸、激素等生物大分子以及細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等物質(zhì)的分離與純化。特別是對(duì)分離含量極少而又不穩(wěn)定的活性物質(zhì)最有效，經(jīng)一步親和色譜即可純化幾百至幾千倍。①選擇性高、特異性極強(qiáng)②操作條件溫和③回收率高親和色譜的局限性①普遍性、通用性不夠②費(fèi)用高親和色譜的特點(diǎn)1基本原理親和色譜是應(yīng)用生物高分子物質(zhì)能與相應(yīng)專一配基分子可逆結(jié)合的原理將配基通過(guò)共價(jià)鍵牢固地結(jié)合于固相載體上制得親和吸附系統(tǒng)。生物分子與配體特異結(jié)合，具有高度的特異性和親和力。親和層析過(guò)程2親和吸附劑的制備1.載體的選擇①載體必須具有較好的理化穩(wěn)定性和生物惰性，非專業(yè)吸附小。②具有大量可供活化和配體結(jié)合的化學(xué)基團(tuán)，以供與配體共價(jià)連接之用。③載體必須具有高度的水不溶性和親水性。④載體必須有稀松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)使大分子能自由進(jìn)入⑤載體要有良好的機(jī)械性能，顆粒均勻。1.載體的選擇常用的親和色譜載體

主要有多孔玻璃載體、聚丙稀酰胺載體、纖維素載體、葡聚糖凝膠載體、瓊脂糖凝膠和交聯(lián)瓊脂糖凝膠載體等。2.配體的選擇根據(jù)配基應(yīng)用和性質(zhì)，可將其分為兩類：特殊配體和通用配體。特殊配體有某一抗原的抗體、某一酶的專用抑制劑、某一激素的受體等。通用配體可適用于一類物質(zhì)的分離提純，如用NADH作脫氫酶類親和層析的通用配體。2.配體的選擇首先，應(yīng)當(dāng)僅僅識(shí)別被純化的目的物。其次，配體與配基應(yīng)該有足夠大的親和力。再次，配體與相應(yīng)目的物之間的結(jié)合應(yīng)具有可逆性。第四，配體具有足夠的穩(wěn)定性，能夠耐受反應(yīng)條件以及清洗合再生等條件。最后，配體的分子大小必須合適。3.載體的活化與偶聯(lián)載體由于其相對(duì)的惰性，往往不能直接與配體連接，偶聯(lián)前一般需先活化，載體表面經(jīng)過(guò)活化后產(chǎn)生的活性基團(tuán)可以在簡(jiǎn)單的化學(xué)條件下與配基上的氨基、羧基、羥基和醛基等功能基團(tuán)發(fā)生共價(jià)結(jié)合反應(yīng)，這一過(guò)程稱為配體的鍵合。載體表明的基團(tuán)必須具有通用性合高效性，可以與上述配體上的常見基團(tuán)發(fā)生簡(jiǎn)單、快速的反應(yīng)。3.載體的活化和配體的連接1.溴化腈活化法2.環(huán)氧基活化法3.硅膠的活化3影響吸附劑親和力的因素

1.配體濃度對(duì)于親和力低的系統(tǒng)，為了取得較好的配體分離效果，必須提高載體上配體的有效濃度。2.空間障礙在制備有些吸附劑時(shí)需要在載體與配體之間插入一段適當(dāng)長(zhǎng)度的多烴鏈“手臂”，以增加與載體相連的配體的活動(dòng)度并減輕載體的立體障礙。3影響親和作用的因素

3.配體.與載體的結(jié)合位點(diǎn)在多肽或蛋白質(zhì)等大分子作配體時(shí)，必須使它以最少的鍵與載體連接。4.載體孔徑載體孔隙是配基向配體接近的運(yùn)動(dòng)通道，所以載體的孔徑大小對(duì)吸附劑的親和能力有決定性影響。4親和色譜操作條件的選擇1.吸附條件的選擇①吸附反應(yīng)條件

最好是自然狀態(tài)下配體與目的分子之間反應(yīng)的最佳條件。②流速控制

不能太快③吸附時(shí)間的控制

延長(zhǎng)時(shí)間可促進(jìn)吸附④進(jìn)樣量的大小

減少進(jìn)樣量，可提高吸附效果。4親和色譜操作條件的選擇2