DB36T 1869-2023 香菇菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程

ICS65.020.20CCSB30DB36TechnicalregulationforspawnproductionofLentinulaedodes江西省市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB36/T1869—2023前言 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14菌種生產(chǎn)要求 25母種生產(chǎn) 36原種、栽培種生產(chǎn) 57貯存與菌種生產(chǎn)檔案 9DB36/T1869—2023本文件按照GB/T1.1-2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別專利的責(zé)任。本文件由江西省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出并歸口。本文件起草單位：江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所。本文件主要起草人：王赟萍、張誠、馬吉平、鐘國祥、王素貞、肖銀潤、熊小文，李偉紅。1DB36/T1869—2023香菇菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程本文件規(guī)定了香菇（Lentinulaedodes）菌種的術(shù)語和定義、菌種生產(chǎn)要求、母種生產(chǎn)、原種與栽培種生產(chǎn)、貯存與菌種生產(chǎn)檔案等內(nèi)容。本文件適用于江西省區(qū)域香菇母種、原種和栽培種菌種生產(chǎn)要求。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB9688食品包裝用聚丙烯成型品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB19170香菇菌種GH/T1013香菇NY/T528食用菌菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程N(yùn)Y/T1284食用菌菌種中雜菌及害蟲的檢驗(yàn)NY/T1731食用菌菌種良好作業(yè)規(guī)范NY/T1742食用菌菌種通用技術(shù)要求NY/T1935食用菌栽培基質(zhì)質(zhì)量安全要求3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1香菇Lentinulaedodes香菇又名香孽、香信、香苑、冬菇、椎茸(日本)。屬擔(dān)子菌門（Basidiomycota）、傘菌亞門（Agaricomycotina）、傘菌綱（Agaricomycetes）、傘菌目（Aganicales）、光茸菌科(Omphalotaceae)、小香菇屬（Lentinula）的一類木腐菌，子實(shí)體肉質(zhì)或近肉質(zhì)。[來源：GH/T1013-2015，3.1，有改動(dòng)]3.2菌種spawn通過生產(chǎn)試驗(yàn)具有特異性、均一性和穩(wěn)定性，且豐產(chǎn)性好、抗逆性強(qiáng)，生長在適宜基質(zhì)上的培養(yǎng)物，包括母種、原種和栽培種。3.3母種stockculture2DB36/T1869—2023經(jīng)分離、雜交、誘變等各種方法選育得到的具有結(jié)實(shí)性的香菇菌絲體純培養(yǎng)物及其繼代培養(yǎng)物，以玻璃試管為培養(yǎng)容器和使用單位，也稱為一級種、試管種。[來源：GB19170-2003，3.1，有改動(dòng)]3.4原種motherspawn由母種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以玻璃菌種瓶或塑料菌種瓶或（12～17）cm×（22~28）cm×（0.004～0.005）cm聚丙烯塑料袋為容器，也稱為二級種。3.5栽培種plantingspawn由原種移植、擴(kuò)大培養(yǎng)而成的菌絲體純培養(yǎng)物。常以菌種瓶（玻璃瓶或塑料瓶）或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.004～0.005）cm聚丙烯塑料袋為容器。栽培種只能用于栽培，不可再次擴(kuò)大繁殖菌種，也稱為三級種。3.6固體菌種solidspawn以富含木質(zhì)素、纖維素和淀粉等天然有機(jī)物為主要原料，添加適量的有機(jī)氮源和無機(jī)鹽類，具一定水分含量的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)的純菌絲體。3.7液體菌種liquidspawn指采用與母種營養(yǎng)成份相似但不添加瓊脂的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)而得到的純菌絲體，菌絲體在培養(yǎng)基中呈絮狀或球狀，液體菌種可以作為原種或栽培種使用。4菌種生產(chǎn)要求4.1人員要求香菇菌種生產(chǎn)所需要的技術(shù)人員和檢驗(yàn)人員應(yīng)經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)、掌握香菇基礎(chǔ)知識及香菇菌種生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程要求。4.2場所和廠房要求香菇菌種生產(chǎn)應(yīng)選擇地勢高、通風(fēng)良好、空氣清新、水源近、排水通暢和交通便利的場所。周邊無污染源。香菇菌種生產(chǎn)廠房要求有各自隔離的攤曬場、原材料庫和配料分裝庫。配套有配料室、攪拌室、裝袋（瓶）室、滅菌室、冷卻室、接種室、培養(yǎng)室（通風(fēng)好，有紗窗）、菌種檢測室及菌種冷藏庫等各環(huán)節(jié)的設(shè)施。冷卻室、接種室和培養(yǎng)室都應(yīng)要有凈化設(shè)施和無菌設(shè)施。4.3生產(chǎn)設(shè)備要求3DB36/T1869—2023香菇菌種生產(chǎn)需要電子秤、攪拌機(jī)、裝袋（瓶）機(jī)、高壓滅菌鍋或常壓滅菌鍋、臭氧離子發(fā)生器、超凈工作臺或接種箱、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)架、搖床、菌種發(fā)酵罐、冰箱、空調(diào)、顯微鏡等設(shè)備。5母種生產(chǎn)5.1生產(chǎn)流程培養(yǎng)基配制→分裝試管→滅菌→冷卻→無菌檢驗(yàn)→接種→培養(yǎng)→檢驗(yàn)→母種。5.2容器試管一般選用18mm×180mm或者20mm×200mm。5.3培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方如下：配方一：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，加水至1000mL。如果配方中的葡萄糖替換成蔗糖，稱為PSA培養(yǎng)基。配方二：CPDA培養(yǎng)基(綜合馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基)：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂0.5g，瓊脂20g，加水至1000mL。5.4分裝分裝培養(yǎng)基至試管1/4～1/3處，用棉塞或硅膠塞封閉試管口，每5支試管為1捆，牛皮紙或報(bào)紙包棉塞，棉線扎緊，棉塞向上放置。棉塞應(yīng)采用梳棉，不能使用脫脂棉。5.5滅菌放入高壓滅菌鍋滅菌，在121℃~124℃（0.11MPa～0.12MPa）下滅菌25min。5.6冷卻滅菌后溫度降到55℃~65℃時(shí)，在空氣清潔的室內(nèi)擺斜面，要求斜面長度不超過試管長度的2/3。5.7無菌檢驗(yàn)抽取3%～5%冷卻的試管，在28℃下培養(yǎng)48h，無微生物長出為滅菌合格。5.8母種制備5.8.1超凈工作臺消毒先用75%酒精棉球?qū)⒊瑑艄ぷ髋_以及接種工具表面擦拭消毒，再打開紫外燈照射30min。5.8.2香菇菌種分離挑選生長長勢良好、形狀規(guī)則、未開傘、無蟲蛀的香菇子實(shí)體作為種菇，用75%的酒精棉球?qū)ΨN菇表面擦洗消毒，并用無菌濾紙充分吸干后放置在潔凈的培養(yǎng)皿中。用雙手將菇體掰開，用無菌接種刀，在菌蓋與菌柄交界處切取10mm×5mm“目”字形組織小塊為接種材料。用接種針挑取一小塊組織片，迅速地接入試管斜面培養(yǎng)基的中央，然后將試管口和棉塞在酒精燈火焰上過火滅菌后塞好，將接種后的試管放入25℃的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，2d～3d后組織塊及周圍便長出白色的菌絲，待菌絲長滿試管斜面即可。4DB36/T1869—20235.8.3轉(zhuǎn)管培養(yǎng)選取斜面上菌絲茁壯、長勢優(yōu)良的試管，用接種工具挑取（3～5）mm×(3～5)mm的菌塊，按無菌操作要求，轉(zhuǎn)接到新的試管培養(yǎng)基中，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15d～20d，當(dāng)菌絲長滿培養(yǎng)基表面，即成母種，可用于生產(chǎn)原種。5.8.4菌種檢查接種48h后應(yīng)做首次檢查，挑揀出未萌發(fā)或污染母種。母種菌落長至直徑2cm左右時(shí)，進(jìn)行第二次檢查，待菌絲長滿培養(yǎng)基前再檢查一次，剔除或丟棄污染、生長不良的菌種。5.8.5母種檢查要求母種形態(tài)要求見表1。表1香菇母種形態(tài)要求無無6原種與栽培種生產(chǎn)6.1生產(chǎn)技術(shù)流程培養(yǎng)基配制→裝袋（瓶）→滅菌→冷卻→接種→培養(yǎng)→檢查→原種（栽培種）。6.2固體菌種生產(chǎn)6.2.1培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方如下：a）配方一：雜木屑78%、麥麩20%、石膏粉1%、白糖或紅糖1%；b）配方二：雜木屑78%、麥麩18%、玉米粉2%、石膏1%、白糖或紅糖1%；c）配方三：雜木屑79%、麥麩20%、石膏1%；d）配方四：雜木屑63%、棉籽殼15%、麥麩20%、石膏1%、白糖或紅糖1%；5DB36/T1869—2023e）配方五：雜木屑63%、玉米芯粉15%、麥麩20%、白糖或紅糖1%、石膏1%。所有原料應(yīng)符合NY/T1935規(guī)定。6.2.2拌料按照培養(yǎng)料配方準(zhǔn)確稱取生產(chǎn)所需各種原材料。將原料加水混合后充分拌勻。培養(yǎng)料含水量控制在60%～65%。6.2.3容器原種采用850mL以下、瓶口直徑≤4cm、耐126℃高溫的透明玻璃瓶，或采用（12～17）cm×（22~28）cm×（0.004～0.005）cm的聚丙烯塑料袋。栽培種采用同原種要求的玻璃瓶子，或（15～17）cm×（33～35）cm×（0.004～0.005）cm的聚丙烯塑料袋。以上聚丙烯塑料袋均要求符合GB9688要求。6.2.4裝袋（瓶）采用裝袋（瓶）機(jī)或人工進(jìn)行裝袋（瓶人工裝袋（瓶）需用打孔器在袋口處打孔，孔直徑1cm~1.5cm，深度為8cm～12cm，每袋（瓶）裝培養(yǎng)基500g～600g。6.2.5滅菌培養(yǎng)基質(zhì)裝袋（瓶）后4h內(nèi)進(jìn)行滅菌。高壓滅菌：培養(yǎng)基在121℃~124℃（0.11MPa～0.14MPa）下滅菌2h。常壓滅菌：在3h之內(nèi)使滅菌溫度達(dá)到100℃,保持100℃10h～12h。6.2.6冷卻滅菌完成后取出，置于凈化冷卻區(qū)域冷卻至室溫。6.2.7接種6.2.7.1接種前準(zhǔn)備先用75%酒精棉球?qū)⒔臃N袋（瓶）以及接種工具表面擦拭消毒，放入接種箱或接種室內(nèi)，再對接種箱或接種室進(jìn)行消毒。6.2.7.2接種操作6.2.7.2.1原種接種前一天備好母種，嚴(yán)格按照無菌操作要求，將接種工具在酒精燈火焰上方灼燒滅菌，冷卻后挑取2cm2左右的菌塊到菌袋(瓶)中，每支母種接原種6～8袋(瓶)。6.2.7.2.2栽培種接種前一天備好原種，嚴(yán)格按照無菌操作要求，將接種工具在酒精燈火焰上方灼燒滅菌，冷卻后挑取5g～6g塊狀原種到菌袋(瓶)中，每袋(瓶)原種接栽培種60～100袋(瓶)。6.2.8培養(yǎng)溫度控制在22℃~26℃,空氣濕度在60%～75%，通風(fēng)避光培養(yǎng)。6DB36/T1869—20236.2.9質(zhì)量檢查原種及栽培種在培養(yǎng)期間，按照NY/T1284要求進(jìn)行檢查。6.2.10原種和栽培種形態(tài)要求原種和栽培種形態(tài)要求見表2。表2香菇原種、栽培種形態(tài)要求無無6.3液體菌種生產(chǎn)6.3.1搖瓶液體菌種生產(chǎn)6.3.1.1培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方如下：1）配方一：葡萄糖20g，蛋白胨5g，酵母膏3g，磷酸二氫鉀3g，硫酸鎂1.5g，維生素B15mg，加水至1000mL，pH6.0～6.5；2）配方二：玉米粉20g，葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏4g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，維生素B15mg，加水至1000mL，pH6.0～6.5。玉米粉應(yīng)過20目篩。6.3.1.2培養(yǎng)基配制按液體培養(yǎng)基配方配制，玉米粉先用水?dāng)嚢杈鶆颍b入三角瓶中，混合均勻，裝液量為搖瓶容量的2/5～3/5，封口膜（耐高溫組培封口膜）或棉塞封口，棉塞需用硫酸紙或牛皮紙包扎。6.3.1.3滅菌7DB36/T1869—2023將分裝好的搖瓶放入滅菌鍋內(nèi)，鍋內(nèi)留有一定的空隙。滅菌蒸汽壓力升至0.1MPa～0.12MPa，恒壓維持35min～40min。6.3.1.4接種與培養(yǎng)待培養(yǎng)基冷卻后置于消毒過的超凈工作臺上，用經(jīng)火焰消毒并冷卻后的接種針挑取5～6塊（3～5）mm×（3～5）mm的母種塊迅速轉(zhuǎn)接于待接種搖瓶培養(yǎng)基內(nèi)。將接種后的三角瓶置于搖床上振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為160rpm，23℃~25℃下培養(yǎng)7d。搖瓶培養(yǎng)期間應(yīng)定期檢查，及時(shí)剔除污染雜菌的三角瓶。6.3.2發(fā)酵罐液體菌種生產(chǎn)6.3.2.1煮罐、空消發(fā)酵罐初次使用、出現(xiàn)雜菌、長期放置、更換品種等情況出現(xiàn)其一時(shí)，應(yīng)煮罐和空消。蒸氣壓力0.15MPa、溫度126℃,維持40min。6.3.2.2液體菌種培養(yǎng)基配方培養(yǎng)基配方如下：a）配方1：玉米粉20g，葡萄糖20g，酵母膏5g，牛肉膏4g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，維生素B15mg，消泡劑0.3g，加水至1000mL，PH6.0～6.5。b）配方2：馬鈴薯100g（煮汁），葡萄糖10g，麥麩40g（煮汁），蛋白胨2g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，消泡劑0.3g，加水至1000mL，pH6.0～6.5。c）配方3：玉米粉20g，麥麩20g（煮汁），葡萄糖20g，蛋白胨5g，磷酸二氫鉀2g，硫酸鎂1g，消泡劑0.3g，加水至1000mL，pH6.0～6.5。玉米粉應(yīng)過20目篩。6.3.2.3投料和定容用水把淀粉、玉米粉等原料攪拌均勻，不能有結(jié)塊，通過吸管或漏斗加入罐體，裝液量為罐體容量的70%～80%，加入0.03%消泡劑，通入空氣攪拌1min～2min，混合均勻，擰緊上料口蓋。6.3.2.4滅菌發(fā)酵罐加熱層通入冷水，水位低于排水口20cm，關(guān)閉進(jìn)、排水閥門加熱。待加熱層蒸汽壓力達(dá)到0.05MPa時(shí)，緩慢打開排氣閥降壓至0MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11MPa，待發(fā)罐培養(yǎng)層蒸汽壓力達(dá)到0.05MPa時(shí)，緩慢打開排氣閥降壓至0MPa，關(guān)閉排氣閥，再次升壓至0.11MPa，同時(shí)打開空氣過濾器滅菌，微開排氣閥，維持50min～60min。6.3.2.5冷卻滅菌結(jié)束，關(guān)閉空氣過濾器滅菌閥與排氣閥，緩慢打開空氣過濾器排水閥降壓至0MPa，加熱層通入冷水降溫；同時(shí)緩慢打開發(fā)酵罐培