《選修三》專題1 基因工程《基因工程的基本操作程序》課件

《選修三》專題1基因工程

1.2基因工程的基本操作程序問題探討

你知道培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉一般需要哪些步驟嗎?基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定一.目的基因的獲取目的基因：用于改變受體細胞性狀或獲得預(yù)期表達產(chǎn)物等的基因。主要是指編碼蛋白質(zhì)的基因。

如與生物抗逆性、優(yōu)良品質(zhì)、生產(chǎn)藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關(guān)的基因。

培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉用到的目的基因——Bt抗蟲蛋白基因，簡稱Bt基因：蘇云金桿菌通過產(chǎn)生蘇云金桿菌伴孢晶體蛋白(Bt抗蟲蛋白)，破壞鱗翅目昆蟲的消化系統(tǒng)來殺死棉鈴蟲?？茖W(xué)家通過實驗，將該細菌的“殺蟲基因”轉(zhuǎn)到棉花里，讓棉花也能產(chǎn)生Bt抗蟲蛋白抵抗蟲害。小資料

當Bt抗蟲蛋白被分解為多肽后，多肽與害蟲腸上皮細胞的特異性受體結(jié)合，導(dǎo)致細胞膜穿孔，最后造成害蟲死亡。 Bt抗蟲蛋白只有在某類昆蟲腸道的堿性環(huán)境中才能表現(xiàn)出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，腸道細胞也沒有特異性受體。

因此，Bt抗蟲蛋白不會對人畜產(chǎn)生上述影響。

那么，如何獲取目的基因呢?1.從基因文庫中獲取目的基因基因文庫：將含有某種生物的不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，各個受體菌分別含有該生物的不同的基因?；蚪M文庫——包含一種生物所有的基因；部分基因文庫——只包含一種生物的一部分基因，如cDNA文庫?；蚪M文庫的構(gòu)建這個群體包含了這種生物的所有基因，叫做這種生物的基因組文庫。受體菌DNA將某種生物體內(nèi)的DNA全部提取出來，選用適當?shù)南拗泼?，將DNA切成一定范圍大小的DNA片段。將這些DNA片段分別與載體連接起來。導(dǎo)入受體菌的群體中儲存，每個受體菌都含有一段不同的DNA片段。真核細胞基因結(jié)構(gòu)示意圖啟動子：RNA聚合酶結(jié)合位點非編碼區(qū)編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子內(nèi)含子反轉(zhuǎn)錄法：

以目的基因轉(zhuǎn)錄成的mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補的單鏈DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈DNA（即cDNA）。

cDNA與載體連接后，儲存在受體菌群中。cDNA文庫的構(gòu)建目的基因轉(zhuǎn)錄成mRNAmRNA內(nèi)含子的去除mRNA為模板反轉(zhuǎn)錄成DNA反轉(zhuǎn)錄完成以DNA為模板合成雙鏈DNA形成不含內(nèi)含子的雙鏈DNAcDNA文庫和基因組文庫的比較2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因多聚酶鏈式反應(yīng)縮寫為PCR。原理：DNA半保留復(fù)制。前提：有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便合成引物。PCR擴增儀2.利用PCR技術(shù)擴增目的基因條件：①模板：DNA的兩條鏈②原料：四種脫氧核苷酸③酶：熱穩(wěn)定DNA聚合酶(Taq酶）④引物（一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補配對的短單鏈核酸，使DNA聚合酶能夠從引物的3’端開始連接脫氧核苷酸。）⑤反應(yīng)需在一定的緩沖液中進行⑥溫度控制PCR的過程變性（90～95℃）復(fù)性（55～60℃）延伸（70～75℃）目的基因DNA受熱變性后解鏈為單鏈；引物與單鏈相應(yīng)互補序列結(jié)合；在DNA聚合酶作用下進行延伸。如此重復(fù)循環(huán)多次。2n3.人工合成

前提：

基因比較??；

核苷酸序列已知。技術(shù)方法：通過DNA合成儀用化學(xué)方法直接人工合成。二.基因表達載體的構(gòu)建

獲取了足夠量的Bt基因后，下一步就是要讓基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代；同時，使Bt基因能夠表達和發(fā)揮作用，這就需要構(gòu)建基因表達載體。

這一步是培育轉(zhuǎn)基因抗蟲棉的核心工作。二.基因表達載體的構(gòu)建限制酶限制酶獲取目的基因目的基因限制酶切割位點質(zhì)粒限制酶切割位點

重組DNA分子

DNA連接酶目的基因與載體的結(jié)合過程，實際上是不同來源的基因重組的過程。相同的黏性末端思考作為基因工程表達載體，只含有目的基因就可以完成任務(wù)嗎？為什么？不可以。因為目的基因在表達載體中得到表達并發(fā)揮作用，還需要有其他的調(diào)控元件，如啟動子，終止子和標記基因等。（1）沒有啟動子和終止子，目的基因?qū)o法轉(zhuǎn)錄。（2）目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標記。（3）為了增強目的基因的表達水平，往往還要增加一些其他的調(diào)控元件，如增強子。（4）有時需要確定目的基因表達產(chǎn)物的存在部位，往往要加上可以標識存在部位的基因，如綠色熒光蛋白基因等。基因表達載體模式圖重組DNA分子插入基因終止子：轉(zhuǎn)錄終止部位啟動子：RNA聚合酶識別和結(jié)合部位（轉(zhuǎn)錄起始部位）標記基因：用于鑒別受體細胞是否含有目的基因復(fù)制原點目的：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳給下一代，同時使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。《選修三》專題1基因工程

1.2基因工程的基本操作程序基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建將目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定三.將目的基因?qū)胧荏w細胞構(gòu)建好的基因表達載體需要通過一定的方式才能進入受體細胞。轉(zhuǎn)化——目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的過程。方法導(dǎo)入植物細胞導(dǎo)入動物細胞導(dǎo)入微生物細胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法——顯微注射法——感受態(tài)細胞吸收DNA分子1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）花粉管通道法（將Bt基因?qū)朊藁毎┰谥参锸芊酆蟮囊欢〞r間內(nèi)，剪去柱頭，將DNA溶液滴加在花柱切面上，使目的基因借助花粉管通道進入胚囊。特點：簡便經(jīng)濟。1.將目的基因?qū)胫参锛毎攸c：經(jīng)濟有效。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法農(nóng)桿菌特點：易感染雙子葉植物和裸子植物。Ti質(zhì)粒的T-DNA可轉(zhuǎn)移至受體細胞染色體的DNA上。1.將目的基因?qū)胫参锛毎?）基因槍法（微彈轟擊法）操作程序：基因表達載體↓包裹在金屬顆粒（金粉、鎢粉）表面↓打入受體細胞特點：用于單子葉植物，成本高。2.將目的基因?qū)雱游锛毎荏w細胞：受精卵技術(shù)：顯微注射技術(shù)操作程序：將表達載體注射入受精卵↓胚胎早期培養(yǎng)↓移植到雌性動物輸卵管或子宮內(nèi)發(fā)育成個體將目的基因注射到動物細胞3.將目的基因?qū)胛⑸锛毎?.原核生物作受體細胞的原因：繁殖快、多為單細胞、遺傳物質(zhì)相對少。2.常用受體菌：大腸桿菌3.轉(zhuǎn)化方法：Ca2+處理細胞→感受態(tài)細胞→表達載體與感受態(tài)細胞混合→在一定溫度下促進感受態(tài)細胞吸收DNA分子，完成轉(zhuǎn)化。感受態(tài)細胞：用Ca2+處理細胞，使細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)。四.目的基因的檢測與鑒定

目的基因進入受體細胞后，是否穩(wěn)定維持和表達其遺傳特性，只有通過檢測與鑒定才能知道，這也是檢查轉(zhuǎn)基因抗蟲棉是否培育成功的一步。

分子水平檢測個體水平鑒定①檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因②檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA③檢測目的基因是否翻譯出蛋白質(zhì)抗蟲鑒定、抗病鑒定、活性鑒定等1.DNA分子雜交目的：檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因。方法：探針+轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA。用放射性標記的、含有目的基因的DNA片段。2.分子雜交目的：檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA。方法：從轉(zhuǎn)基因生物中提取mRNA，用標記的目的基因做探針，與mRNA雜交，如顯示出雜交帶，則表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA。3.抗原-抗體雜交目的：檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)。方法：從轉(zhuǎn)基因生物中提取蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的抗體進行抗原-抗體雜交，若出現(xiàn)雜交帶，表明目的基因已形成蛋白質(zhì)產(chǎn)品。4.個體水平鑒定做抗蟲或抗病接種實驗；或?qū)蚬こ坍a(chǎn)品進行功能活性比較。如：通過采摘抗蟲棉的葉片飼喂棉鈴蟲來確定Bt基因是否賦予了棉花抗蟲特性以及抗性的程度。抗蟲棉的接種實驗（左為抗蟲轉(zhuǎn)基因棉，使蟲體發(fā)育不正常）思考聯(lián)系前面有關(guān)細胞器功能的知識，結(jié)合基因工程操作程序的基本思路思考：若要生產(chǎn)人的糖蛋白，可以用大腸桿菌嗎？提示：有些蛋白質(zhì)肽鏈上有共價結(jié)合的糖鏈，這些糖鏈是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體上加工完成的，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體存在于真核細胞中，大腸桿菌不存在這兩種細胞器，因此在大腸桿菌中生產(chǎn)這種糖蛋白是不可能的?？偨Y(jié)基因工程的基本操作程序目的基因的獲取基因表達載體的構(gòu)建目的基因?qū)胧荏w細胞目的基因的檢測與鑒定從基因文庫中獲取利用PCR技術(shù)擴增人工合成基因組文庫cDNA文庫原理：DNA半保留復(fù)制大致過程構(gòu)建目的構(gòu)建零件及其作用導(dǎo)入植物細胞的方法導(dǎo)入動物細胞的方法導(dǎo)入微生物細胞的方法分子水平的檢測個體生物學(xué)水平的檢測反饋練習

解旋酶氫鍵

反饋練習2.閱讀如下資料:

科學(xué)家將牛生長激素基因?qū)胄∈笫芫阎?得到了體型巨大的“超級小鼠”;科學(xué)家采用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法培育出轉(zhuǎn)基因煙草。

回答下列問題：此資料屬于基因工程的范疇。將基因表達載體導(dǎo)入小鼠的受精卵中常用_________法。構(gòu)建基因表達載體常用的工具酶是___