(高清版)DB22∕T 396-2014 保健用品毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法　　

備案號(hào)：42265-2014DB22DB22/T396—2014保健用品毒理學(xué)評(píng)價(jià)程序與檢驗(yàn)方法Toxicologyassessmentprocedureandtestmethodsforhealthproduct2014-05-04發(fā)布2014-06-01實(shí)施吉林省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I 1 1 1 1 2 2 7 ——補(bǔ)充了經(jīng)皮保健用品毒性試驗(yàn)，皮膚急性毒性試驗(yàn)中的皮膚——增加了經(jīng)皮保健用品毒性試驗(yàn)，皮膚急性毒——調(diào)整了經(jīng)皮保健用品毒性試驗(yàn)，皮膚刺激性試驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)1）；2.2.1保健用品的材料為常用原料，使用期限不超過(guò)二周者，僅進(jìn)行第一階22.2.3保健用品的受試人群與妊娠或兒童有關(guān)，影響胎兒及子代發(fā)育，在長(zhǎng)2.2.4保健用品在致突變?cè)囼?yàn)中，有一項(xiàng)或一項(xiàng)以上試驗(yàn)為陽(yáng)性者，需作第1十 2 十 3——十4—十—5—十十6 十7 十8±——9—±—±±±±±±±±±±±±±±±—±—a)動(dòng)物：選用兩種性別的成年小鼠和/或大鼠b)受試物溶液的配制:常用蒸餾水或食用植物油為溶劑。若受試物是體積較小不溶于水或油的粉末劑，可用0.5%羧甲基纖維素鈉、10%阿拉伯膠、植物油制成混懸液。礦化容器類3d)環(huán)境條件：環(huán)境溫度控制在20℃~25℃之間。一般分為5個(gè)～6個(gè)劑量組。每組動(dòng)物數(shù)10只，根據(jù)所選LD50計(jì)算方法而定。各正式試驗(yàn)時(shí)將動(dòng)物稱重，并隨機(jī)分組，然后用特制的灌胃針估計(jì)受試物毒性較低，一次給受試物容積太大，也可一日內(nèi)多次給予（每次間隔4h～6h，24h內(nèi)不超過(guò)3次，盡可能達(dá)到最大劑量，合并作為一次劑量計(jì)算）。給予受試物后，密切觀察動(dòng)物反應(yīng)情況，每天觀察一次，連續(xù)觀察7d，逐日記錄鼻眼標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及判定受試物經(jīng)消化道攝入后引起動(dòng)物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時(shí)一定驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等，評(píng)價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)(包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)與其它毒性作用)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。根據(jù)43.1.2.2.3最大耐受量確定后，應(yīng)推算出相當(dāng)于臨床給受試物日劑量的倍5用5周齡～6周齡大鼠。試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)，體重差異應(yīng)在20%范圍內(nèi)，雌雄各半，按性別、體重隨機(jī)區(qū)間分再加1%左右羧甲基纖維素鈉或10%左右阿拉伯膠助懸、植物油制成混懸液。臨用前搖勻，避免混設(shè)三個(gè)或三個(gè)以上的劑量組。高劑量組應(yīng)有少數(shù)動(dòng)物出現(xiàn)嚴(yán)重毒性反克/體重計(jì)算）。如因受試物體積過(guò)大，達(dá)不到這一要求時(shí)，最低不能低于臨床劑量的30倍，且必量一般為1ml～2ml/100gBW，各劑量組間應(yīng)采用等容量a)死亡：死亡是動(dòng)物最明顯的表現(xiàn)，但須注意鑒別確系受試物中毒死亡，而與自然死亡或死亡區(qū)別開(kāi)來(lái)。發(fā)現(xiàn)死亡動(dòng)物應(yīng)立即進(jìn)行尸檢，尋找死亡原因。最好在動(dòng)物中毒臨終前活殺6d)毒性癥狀：給受試物后應(yīng)每天注意有無(wú)毒性癥狀出現(xiàn)，專人負(fù)責(zé)觀察和記錄。物第一周內(nèi)，毒性癥狀出現(xiàn)最多，必須嚴(yán)密觀察，及時(shí)發(fā)現(xiàn)。如一般行為，運(yùn)動(dòng)功能，呼吸的頻率和性質(zhì)，有無(wú)腹瀉、腹痛、便血、眼、耳、鼻、口腔、外陰部有無(wú)異常或分泌物。群養(yǎng)時(shí)應(yīng)將發(fā)現(xiàn)中毒反應(yīng)的動(dòng)物及時(shí)取出單籠飼養(yǎng)，重點(diǎn)觀察。毒性癥狀有些只在給受試物后的一定階段出現(xiàn)，以后逐漸自行消失或減輕；有些則隨時(shí)間而進(jìn)行性發(fā)展。因此必須列表逐日或逐周（逐個(gè)動(dòng)物）記錄，以便看出癥狀發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，以及各種癥狀出現(xiàn)的先后次b)臟器稱重和計(jì)算臟器系數(shù)：心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胸腺、辜丸、卵巢和可能的靶器官稱重并計(jì)算臟器系數(shù)。急性毒性試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)明顯毒性者，至少應(yīng)測(cè)k=m1........................................(2)2m2c)病理組織學(xué)檢查：取材后立即放進(jìn)10%福爾馬林中固定。并根據(jù)所含中藥的性、味、先作高劑量組和對(duì)照組的組織學(xué)檢查，其他劑量組可取材10%福爾馬林中固定保存，在高劑7的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。評(píng)價(jià)受試物最小觀察到有害作用劑量和最大未觀察到有害作用劑量及毒性作一般分3個(gè)劑量組，其中一個(gè)為賦形劑對(duì)照組，兩個(gè)給受試物組，高劑量組劑量為低劑量的2倍。為了提高給受試物劑量可提高濃度或增加24h內(nèi)給受試物次數(shù)。大鼠或豚鼠每組10只，家兔每組48級(jí)和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及判定受試物經(jīng)皮膚吸收后引起動(dòng)物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等，評(píng)價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)(包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)與其它毒性作用)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。毒>2180選用成年健康家兔、豚鼠或大鼠。家兔體重2kg左右；豚鼠300g左右，大鼠200g～300g。受試9的劑量-反應(yīng)(效應(yīng))關(guān)系。評(píng)價(jià)受試物最小觀察到有害作用劑量和最大未觀察到有害作用劑量及毒性作和雄性均可，但雌性動(dòng)物應(yīng)是未孕和未曾產(chǎn)仔的。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物至少要用4只。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物應(yīng)單籠飼養(yǎng)，試驗(yàn)前動(dòng)物要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房環(huán)境中至少適應(yīng)3d時(shí)間。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房應(yīng)符合國(guó)家相應(yīng)規(guī)定。選用常受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿（pH值≤2或≥11.5可以不再進(jìn)行皮膚刺激試驗(yàn)。此外，若已知受試物有很強(qiáng)的經(jīng)皮吸收毒性，經(jīng)皮LD50小于200mg/kgb)取受試物約0.5mL（g）直接涂在皮膚上，然后用二層紗布（2.5cm×2.5cm）和一層硫酸紙或類似物覆蓋，再用無(wú)刺激性膠布和繃帶加以固定。另一側(cè)皮膚作對(duì)照。采用封閉試敷用時(shí)間為4h?？筛鶕?jù)人的實(shí)際使用和產(chǎn)品類型，延長(zhǎng)或縮短敷用時(shí)間。對(duì)用后沖洗的產(chǎn)物可能引起嚴(yán)重刺激或腐蝕作用，可采取分段試驗(yàn)，將三個(gè)涂有受試物的紗布?jí)K同時(shí)或先后01234012348a)試驗(yàn)前將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)皮膚的毛剪掉，去毛范圍各為3cm×3cm，涂抹面積2.5b)取受試物約0.5mL(g)涂抹在一側(cè)皮膚上，當(dāng)受試物物無(wú)刺激性溶劑配制時(shí)，另一側(cè)涂溶劑K∑K∑kn2。取受試物0.2mL(或g)，涂在動(dòng)物左側(cè)背部脫毛區(qū)皮膚上，以二層紗布和一層硫酸紙覆于末次給受試物致敏后14d～28d，將受試物約0.2mL（或g）涂于豚鼠背部右側(cè)脫毛區(qū)3.2.4.3.2如激發(fā)接觸所得結(jié)果仍不能確定，應(yīng)于第一次激發(fā)后一周，給予第0123401237弱輕中強(qiáng)在受試者上背部或前臂屈側(cè)皮膚上，再用玻璃紙覆蓋，用無(wú)刺012312345b)受試物為強(qiáng)酸或強(qiáng)堿（pH≤2或≥11.5或已證實(shí)對(duì)皮膚有腐蝕性或強(qiáng)a)輕輕拉開(kāi)家兔一側(cè)眼睛的下眼瞼，將受上、下眼瞼被動(dòng)閉合1s，以防止受試物丟失。另一側(cè)眼睛不處理作自身對(duì)照。滴入受試物除了對(duì)角膜、虹膜、結(jié)膜進(jìn)行觀察外，其它損害效應(yīng)均應(yīng)當(dāng)記錄并報(bào)告。在每次檢查中均應(yīng)012340皺褶明顯加深，充血、腫脹、角膜周?chē)休p度充血，12012301234健康的大鼠、豚鼠或家兔，大鼠體重180g級(jí)和標(biāo)簽標(biāo)識(shí)以及判定受試物經(jīng)鼻吸收后引起動(dòng)物死亡可能性大小的依據(jù)。引用LD50值時(shí)一驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等，評(píng)價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)(包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)與其它毒性作用)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。毒性>2180健康的大鼠、豚鼠或家兔，大鼠體重180g將受試物直接滴鼻或噴霧吸入，受試物同黏膜至少接觸4h。然后于24h處死動(dòng)物，取出鼻黏膜觀0123012310只，家兔每組4只。如果受試物毒性較小，不能求得LD50時(shí)，可求明實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的種屬、性別、染毒途徑、觀察期限等，評(píng)價(jià)應(yīng)包括動(dòng)物接觸受試物與動(dòng)物異常表現(xiàn)(包括行為和臨床改變、大體損傷、體重變化、致死效應(yīng)與其它毒性作用)的發(fā)生率和嚴(yán)重程度之間的關(guān)系。按3.3.4.2.1方法進(jìn)行。受試物與陰道黏在受試物作用4h后，再經(jīng)1h處死，取出陰道組織，觀察有無(wú)充血、腫脹等現(xiàn)象；若有變化，必要一般每日一次，每次接觸4h，連續(xù)一周。0123>2.5，為重度刺激性。一般采用5mg/皿，最低劑量一般為1μg/皿或0.1μg/皿。但如應(yīng)用誘導(dǎo)劑混合物處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶（S9進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加測(cè)試之前，應(yīng)測(cè)定受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞ID50，以受試物作用24h為準(zhǔn)。對(duì)于無(wú)細(xì)胞毒性的化至少設(shè)三個(gè)劑量組，并設(shè)陰性和陽(yáng)性對(duì)照組。高劑量組以1/2LD50為準(zhǔn)。如無(wú)），陰性對(duì)照組的倍量或經(jīng)統(tǒng)計(jì)有顯著性意義，并有劑量反應(yīng)關(guān)系常用試驗(yàn)動(dòng)物為大鼠、小鼠和家兔。傳統(tǒng)致畸應(yīng)選用健康性成熟(90d初次試驗(yàn)可設(shè)一陽(yáng)性對(duì)照組。每組至少12只孕鼠。常用陽(yáng)性對(duì)照物有敵枯雙（0.5mg/kg～1.0mg/kg體重）、五氯酚鈉阿斯匹林(30mg/kg體重)及維組，并稱重和編號(hào)，在受孕的第7d～16d，每天經(jīng)口給予受試物（按0.5m1/100g～1.0m1/100g體重計(jì)）。受孕的0d、7d、12d、16d、20d稱體重，并計(jì)算給受試物的量。動(dòng)物交配期室溫在20℃~大鼠于妊娠20d，小鼠第18d，兔第29d處死。大鼠用2g/l00mL硫噴妥鈉1mL/只～1.5mLDB22/T396—2014逐一記錄胎仔體重、體長(zhǎng)、檢查胎鼠外觀有無(wú)異常，如頭部有無(wú)腦膨出、露腦、小頭、小耳、小眼、無(wú)眼和睜眼、兔唇、下頜裂、軀干部有無(wú)腹壁裂、臍疝、脊柱彎曲，四肢有無(wú)小肢、短肢、并趾、無(wú)趾等，尾部有無(wú)短尾、卷尾、無(wú)尾，肛門(mén)有無(wú)閉鎖。3.4.2.5.4胎鼠骨標(biāo)本的制作與檢查將每窩1/2的活胎(奇數(shù)或偶數(shù))放入95%(V/V)乙醇中固定2周～3周，取出胎仔(或可去皮、去內(nèi)臟及脂肪)流水沖洗數(shù)分鐘后放入1g/100ml～2g/100m1的氫氧化鉀溶液內(nèi)(至少5倍于胎仔體積)8h~72h,透明后放入茜素紅-S應(yīng)用液中染色6h~48h,并輕搖1次/d~2次/d,至頭骨染紅為宜。再放入透明液A中1d~2d,放入透明液B中2d~3d,待骨骼染紅而軟組織基本褪色，將標(biāo)本放入小平皿中，用透射光源，在體視顯微鏡下作整體觀察，然后逐步檢查骨骼。測(cè)量囟門(mén)大小、矢狀縫的寬度、頭頂間骨及后頭骨缺損情況，然后檢查胸骨的數(shù)目，缺失或融合(胸骨為6個(gè)，骨化不全時(shí)首先缺第5胸骨、次為缺第2胸骨)。肋骨通常12對(duì)~13對(duì)，常見(jiàn)畸形有融合肋、分叉肋、波狀肋、短肋、多肋、缺肋、肋骨中斷。脊柱發(fā)育和椎體數(shù)目(頸椎7個(gè)，胸椎12個(gè)~13個(gè)，腰椎5個(gè)~6個(gè)，底椎4個(gè)，尾椎3個(gè)~5個(gè))有無(wú)融合、縱裂等最后檢查四肢骨。3.4.2.5.5胎鼠內(nèi)臟檢查每窩的1/2胎鼠放人Bouins液中，固定兩周后作內(nèi)臟檢查。先用自來(lái)水沖去固定液，將鼠仰放在石蠟板上，剪去四肢和尾，用刀片從頭部到尾部逐段橫切或縱切。按不同部位的斷面觀察器官的大小、形狀和相對(duì)位置。正常切面見(jiàn)圖1。圖1正常切面圖觀察步驟：a)經(jīng)口從舌與兩口角向枕部橫切(切面1),可觀察大腦、間腦、正腦、舌及顎裂；b)在眼前面作垂直縱切(切面2)、可見(jiàn)鼻部；c)從頭部垂直通過(guò)眼球中央作縱切(切面3),沿頭部最大橫位處穿過(guò)腦作切面(切面4),可觀察舌裂、顎裂、眼球畸形、腦和腦室異常；d)沿小顎水平通過(guò)頸部作橫(切面5),可觀察氣管、食管和延腦或脊髓，以后自腹中線剪開(kāi)胸、腹腔，依次檢查心、肺、橫隔膜、肝、胃腸等臟器的大小、位置，查畢將其摘除，再檢查腎臟、輸尿管、膀胱、子宮或睪丸位置及發(fā)育情況。然后將腎臟切開(kāi)，觀察有無(wú)腎孟積水與擴(kuò)大。3.4.2.6結(jié)果評(píng)價(jià)各種率的檢查用X2檢驗(yàn)，孕鼠增重用方差分析或非參數(shù)統(tǒng)計(jì)，胎鼠身長(zhǎng)、體重、窩平均活胎數(shù)用T檢驗(yàn)。結(jié)果應(yīng)能得到受試物是否有母體毒性和胚胎毒性、致畸性，最好能得出最小致畸劑量。為比較不同有害物質(zhì)的致畸強(qiáng)度，可計(jì)算致畸指數(shù)(i),暫以致畸指數(shù)10以下為不致畸，10~100為致畸，100以i=k..................mi——致畸指數(shù)；k=m1........................................(5)2m2試驗(yàn)無(wú)中毒死亡，其體重增長(zhǎng)不低于對(duì)照組10%，機(jī)體一般狀況和實(shí)驗(yàn)室檢查變化不至少應(yīng)采用兩種動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)，常用小鼠和大鼠。各試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組大鼠24個(gè)月以上，小鼠18個(gè)月以上。此時(shí)對(duì)照組和低劑量組一般還應(yīng)有50%以上動(dòng)物存在，次。應(yīng)盡量減少腫瘤以外的死亡率。各組的存活率不少于50%。試驗(yàn)期末解剖或懷疑有血液疾患時(shí)，最3.4.4.1.3根據(jù)保健用品的不同性質(zhì)，斑貼試驗(yàn)時(shí)可選用保健用品原物、或?qū)?12343.4.4.4.3去除受試物斑試器后間隔30min30例受試者中出現(xiàn)2級(jí)皮膚不良反應(yīng)的人數(shù)多于2例（除臭產(chǎn)品斑貼試驗(yàn)2級(jí)皮膚不良反LD50計(jì)算方法預(yù)備試驗(yàn)：通常采用10mg/kg，100mg/kg和1000mg/kg的劑量，各劑量使用2只～3只動(dòng)物。根據(jù)正式試驗(yàn):按預(yù)試所確定大概的致死劑量范圍選用一組適宜的劑量系列，根據(jù)四個(gè)劑量當(dāng)直線劃定后，由圖直線上50%死亡率(機(jī)率單位為5)的相應(yīng)劑量對(duì)數(shù)值先求LD50