結(jié)核分支桿菌(TB)核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程

結(jié)核分支桿菌（TB）核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1.目的：規(guī)范結(jié)核分支桿菌（TB）核酸檢測操作流程，保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.應(yīng)用范圍：PCR實驗室。3.職責(zé)：3.1文件編寫：PCR實驗室技術(shù)員。3.2文件審核：PCR實驗室負(fù)責(zé)人。3.3文件審批：實驗室主任。3.4執(zhí)行：PCR實驗室所有工作人員。4.參考文獻：4.1《中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司結(jié)核分支桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒說明書》4.2《中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司DA7600核酸序列檢測系統(tǒng)用戶手冊》5.內(nèi)容：5.1檢測方法：PCR-熒光探針法。5.2實驗原理：用一對結(jié)核分支桿菌(TB)特異性引物和一條結(jié)核分支桿菌(TB)特異性熒光探針，配以PCR反應(yīng)液、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種核苷酸單體（dNTPs）等成分，通過PCR體外擴增法，即高溫變性、低溫退火、適溫延伸進行DNA擴增，并對PCR全過程進行實時監(jiān)測，從而檢測結(jié)核分支桿菌核酸。主要用于TB感染的輔助診斷及其療效監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)。5.3性能參數(shù)：5.3.1檢測下限：5.0×102基因拷貝/ml。5.3.2線性范圍：5.0×102～5.0×108基因拷貝/ml。5.4標(biāo)本采集：由合作單位按照以下要求進行采集。5.4.1標(biāo)本類型：痰液、肺及支氣管灌洗液、尿液等。5.4.1.1痰液：清晨從肺深部咳出痰液，取1～3ml置于無菌玻璃管內(nèi)，密封送檢；嬰幼兒用密閉容器與無菌吸痰器相連，吸取痰液，密封送檢。5.4.1.2肺及支氣管灌洗液：收集灌洗液1～3ml置于無菌玻璃管內(nèi)，密封送檢；5.4.1.3尿液：用無菌5ml玻璃管收集中段尿1～3ml，密封送檢。5.4.2標(biāo)本保存：標(biāo)本采集后保存于2～8℃。5.4.3運送條件：標(biāo)本運送采用冰壺。5.5設(shè)備和試劑：5.5.1設(shè)備：DA7600熒光定量PCR儀、低速水平離心機、生物安全柜、臺式高速離心機、移液器、混勻器、恒溫水浴箱/干式恒溫器、冰箱（4℃、-20℃）、移動/固定紫外燈、冷凍離心機。5.5.2試劑：5.5.2.1試劑品牌：《中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司結(jié)結(jié)核分支桿菌核酸擴增（PCR）熒光檢測試劑盒》5.5.2.2試劑批準(zhǔn)文號：國食藥監(jiān)械（準(zhǔn)）字2011第3400392號5.5.2.3試劑組成：DNA提取液（500μL/管）2管；TB-PCR反應(yīng)管（未貼標(biāo)簽管）20人份；TB臨界陽性質(zhì)控品（50μL/管）1管；TB強陽性質(zhì)控品（50μL/管）1管；陰性質(zhì)控品（250μL/管）1管。5.5.2.4試劑包裝規(guī)格：單管單人份，20人份/盒。5.5.2.5試劑保存和有效期：保存于-20℃；有效期6個月。5.6操作過程：5.6.1標(biāo)本與質(zhì)控品的處理：5.6.1.1打開恒溫水浴槽或加熱器，設(shè)定溫度100℃。5.6.1.2從試劑盒中取出DNA提取液、陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品，讓其在室溫下完全融化。5.6.1.3痰液標(biāo)本的處理：5.6.1.3.1于痰液中加入4倍體積的4%NaOH，搖勻，室溫放置30分鐘待液化；5.6.1.3.2用槍頭或吸管混勻后吸取1ml液體至1.5ml離心管中，12,000rpm離心5min；5.6.1.3.3去上清，向沉淀中加入滅菌生理鹽水1ml，混勻，12,000rpm離心5min；5.6.1.3.4去上清，向沉淀中加入50μLDNA提取液，充分混勻，100℃恒溫處理10±1min，12,000rpm離心5min，備用。5.6.1.4肺及支氣管灌洗液、尿液的處理：5.6.1.4.1取灌洗液或尿液1.0ml至1.5ml離心管，12,000rpm離心5min；5.6.1.4.2去上清，向沉淀中加入滅菌生理鹽水1ml，混勻，12,000rpm離心5min；5.6.1.4.3去上清，向沉淀中加入50μLDNA提取液，充分混勻，100℃恒溫處理10±1min，12,000rpm離心5min，備用。5.6.2排版：在DA7600熒光定量擴增儀的上機面板表里設(shè)置面板。5.6.3加樣：從-20℃冰箱取出TB-PCR反應(yīng)管若干管轉(zhuǎn)移至加樣區(qū)，根據(jù)上機面板的位置放好后，直接加入處理好的樣本DNA和陰性質(zhì)控、陽性質(zhì)控品各5μL，2,500rpm離心1min。5.6.4DA7600熒光定量擴增儀的設(shè)置及結(jié)果分析：參見《達(dá)安7600熒光定量PCR儀操作、校準(zhǔn)及保養(yǎng)規(guī)程》及《基因擴增檢測及結(jié)果分析規(guī)程》。5.6.5記錄實驗數(shù)據(jù)。5.6.6取出結(jié)束后擴增儀內(nèi)擴增產(chǎn)物需用一次性手套包好、封口后，丟入醫(yī)療廢物垃圾桶內(nèi)，以防止擴增管破裂而導(dǎo)致污染。5.6.7關(guān)閉擴增儀電源和計算機電源。5.7參考值范圍：痰液＜2.5×103基因拷貝/ml,灌洗液/尿液＜5.0×102基因拷貝/ml5.8臨床意義：直接反映人體內(nèi)結(jié)核分支桿菌是否存在及其復(fù)制活躍程度，可作結(jié)核分支桿菌（TB）感染的輔助診斷及其療效監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)。5.9安全防護措施:5.9.1試劑處理:5.9.1.1使用或更換試劑時，務(wù)必戴手套；不要用身體直接接觸試劑，以免損傷皮膚。5.9.1.2如果皮膚接觸了試劑，立即用大量清水沖洗并消毒。5.9.1.3如果眼睛接觸了試劑，立即用噴淋器沖洗，并緊急就醫(yī)。5.9.2儀器使用:5.9.2.1儀器運轉(zhuǎn)中不要觸摸加樣機構(gòu)、試劑分注機構(gòu)、攪拌機構(gòu)、反應(yīng)容器清洗機構(gòu)等可動部分。5.9.2.2儀器通電時不能打開儀器上面、背面、側(cè)面的蓋板，不能觸摸光源燈的玻璃面。5.9.3生物安全防護：參見《生物安全防護手冊》5.10注意事項:5.10.1PCR熒光定量檢測法比較容易受污染，所以實驗過程中應(yīng)避免反復(fù)開蓋，所用耗材均需高壓滅菌。5.10.2試劑使用前要完全解凍，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。5.10.3試劑盒DNA提取液內(nèi)含不溶于水的物質(zhì)，取樣時需用加樣器充分混勻后吸取。如出現(xiàn)因吸頭嘴部太細(xì)不能吸取或取樣后堵塞吸頭的現(xiàn)象，可先用潔凈無污染的剪刀將吸頭嘴部剪去一截。6.相關(guān)記錄表格:6.1LAB-SOP-PCR-005-T01-001《PCR實驗室實驗、交接班記錄表》6.2LAB-SOP-PCR-015-T01-001《PCR實驗室遲發(fā)報告登記表》6.3LAB-SOP-PCR-014-T01-001《PCR實驗室不合格標(biāo)本登記表》6.4LAB-SOP-PCR-025-T01-001《PCR實驗室DA－7600取試劑、加樣、擴增對照圖面版表》

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