《《嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中7種母乳低聚糖的測(cè)定》》

ICSXXX

CCSXXX

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/SAFC002—2024

嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中7種母乳低

聚糖的測(cè)定

DetectionofSevenHumanMilk

Oligosaccharides(HMOs)inInfantFormula

andFormulatedMilkPowder

（征求意見稿）

XXXX-××-××發(fā)布XXXX-××-××實(shí)施

上海市食品化妝品質(zhì)量安全管理協(xié)會(huì)發(fā)布

T/SAFC002—2024

嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中7種母乳低聚糖的測(cè)定

DetectionofSevenHumanMilkOligosaccharides

(HMOs)inInfantFormulaandFormulatedMilk

Powder

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了用高效液相色譜法測(cè)定嬰幼兒配方乳粉及調(diào)制乳粉中母乳低聚糖含量的

方法。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒配方乳粉和調(diào)制乳粉中母乳低聚糖的測(cè)定。

2原理

此方法可對(duì)七種母乳低聚糖進(jìn)行定量（2'-FL、3-FL、3'-SL、6'-SL、LNT、LNnT、DFL）。

樣品經(jīng)水提取后，以淀粉葡萄糖苷酶或復(fù)合添加淀粉葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶進(jìn)行酶解，

衍生后用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，內(nèi)標(biāo)法定量。

3試劑和材料

除非另有說明，本方法所用試劑均為分析純，水為GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。

3.1試劑

3.1.1乙腈（CH3CN）：色譜純。

3.1.2乙酸（CH3COOH）。

3.1.3甲酸銨（NH4HCO2）：色譜純。

3.1.4二甲基亞砜（C2H6OS）。

3.1.52-甲基吡啶硼烷復(fù)合物（C6H10BN）。

3.1.62-氨基苯甲酰胺（C7H8N2O）。

3.1.7淀粉葡萄糖苷酶溶液（3260U/mL）：Megazyme提供，E-AMGDF-40ML，4°C保存。

3.1.8β-半乳糖苷酶溶液（4000U/mL）：Megazyme提供，E-BGLAN，4°C保存。

3.2試劑配制

3.2.150mM甲酸銨溶液：稱取6.3g甲酸銨，用水溶解并稀釋至2000mL。

3.3標(biāo)準(zhǔn)品

3.3.12'-巖藻糖基乳糖（2'-FL）（C18H32O15，CAS號(hào)：41263-94-9）：純度≥98%。

3.3.23-巖藻糖基乳糖（3-FL）（C18H32O15，CAS號(hào)：41312-47-4）：純度≥90%。

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3.3.33'-唾液酸乳糖鈉鹽（3'-SL）（C23H38NO19Na，CAS號(hào)：128596-80-5）：純度≥98%。

3.3.46'-唾液酸乳糖鈉鹽（6'-SL）（C23H38NO19Na，CAS號(hào)：157574-76-0）：純度≥98%。

3.3.5乳糖-N-四糖（LNT）（C26H45NO21，CAS號(hào)：14116-68-8）：純度≥95%。

3.3.6乳糖-N-新四糖（LNnT）（C26H45NO21，CAS號(hào)：13007-32-4）：純度≥98%。

3.3.7乳糖二巖藻糖基四糖（DFL）（C24H42NO19，CAS號(hào)：20768-11-0）：純度≥95%。

3.3.8昆布三糖（C18H32O16，CAS號(hào)：3256-04-0）：純度≥95%。

3.4標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

3.4.1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（1000mg/L）：準(zhǔn)確稱取2'-巖藻糖基乳糖、3-巖藻糖基乳糖、3'-

唾液酸乳糖鈉鹽、6'-唾液酸乳糖鈉鹽、乳糖-N-四糖、乳糖-N-新四糖、乳糖二巖藻糖基四

糖各10mg（精確至0.1mg），置于10mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。

3.4.2內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100mg/L）：準(zhǔn)確稱0.01g（精確至0.1mg）昆布三糖標(biāo)準(zhǔn)品，置于

100mL容量瓶中，加水溶解并定容至刻度，混勻。

3.4.3混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：分別準(zhǔn)確量取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（3.4.1）10μL、50μL、100μL、

200μL、500μL，置于10mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻。混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度

分別為：1mg/L、5mg/L、10mg/L、25mg/L、50mg/L，臨用現(xiàn)配。

4儀器和設(shè)備

4.1高效液相色譜儀：帶熒光檢測(cè)器。

4.2渦旋振蕩器。

4.3水浴鍋

4.4天平：感量為0.1mg和0.01g。

4.5磁力攪拌器。

4.6離心機(jī)。

4.70.45μmPTFE濾膜。

5分析步驟

5.1試樣制備

乳粉充分混勻后，取適量有代表性的試樣。稱取25.0g（精確至0.01g）試樣于燒杯

中，然后加水?dāng)嚢柚镣耆芙?，轉(zhuǎn)移并定容至250mL容量瓶中?；靹蚝笤偃?.0mL溶解后

的樣液，置于50mL容量瓶中，用水定容至刻度，混勻。

5.2酶解

5.2.1添加低聚半乳糖的樣品

量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于2mL微量離心管中，加入50μL淀粉葡萄糖苷酶

溶液（3.1.7）和10μLβ-半乳糖苷酶溶液（3.1.8），混勻，于60°C的水浴中酶解60

min。同時(shí)，再量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于另一2mL微量離心管中，加入50μL

淀粉葡萄糖苷酶溶液（3.1.7），混勻，于60°C的水浴中酶解60min。

5.2.2不添加低聚半乳糖的樣品

量取0.1mL稀釋后的樣品提取液于2mL微量離心管中，加入50μL淀粉葡萄糖苷酶

溶液（3.1.7），混勻，于60°C的水浴中酶解60min。

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5.3試液衍生化

經(jīng)過酶解后的樣品，加入10μL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（3.4.2）和0.1mL衍生試劑（3.2.2），

充分混勻，在65°C水浴中恒溫60min，取出冷卻至室溫。向微量離心管中加入乙腈并定

容至1mL，渦旋混合，過0.45μmPTFE濾膜后，待測(cè)。

另取0.1mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（3.4.3），與試樣同步進(jìn)行衍生。

5.4儀器參考條件

5.4.1色譜柱

5.4.1.1分析柱：XBridgeGlycanBEHAmide，2.5μm（填料粒徑）或相當(dāng)者。

5.4.1.2保護(hù)柱：XBridgeGlycanBEHAmide，2.5μm（填料粒徑）或相當(dāng)者。

5.4.2柱溫：60℃。

5.4.3進(jìn)樣量：10μL。

5.4.4流速：0.8mL/min。

5.4.5流動(dòng)相：A為乙腈，B為50mM甲酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。

表1梯度洗脫程序

時(shí)間流速流動(dòng)相A流動(dòng)相B

（min）（mL/min）（%）（%）

0.000.89010

4.000.89010

38.000.87030

39.000.82080

42.000.82080

42.100.89010

48.000.89010

5.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液（3.4.3）的衍生液分別注入高效液相色譜儀中，測(cè)定相應(yīng)的色

譜峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以響應(yīng)因子為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中響應(yīng)

因子定義為目標(biāo)物的峰面積與內(nèi)標(biāo)物的峰面積的比值。

5.6試樣溶液的測(cè)定

在相同色譜條件下，將制備的試樣溶液分別進(jìn)樣，進(jìn)行高效液相色譜分析。以保留時(shí)間

定性，內(nèi)標(biāo)法定量，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算出試樣溶液中母乳低聚糖的濃度。

6分析結(jié)果的表述

6.1試樣中母乳低聚糖單體含量的計(jì)算公式

試樣中母乳低聚糖單體的含量按式（1）計(jì)算：

……（1）

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式中：

Xi——試樣中母乳低聚糖單體的含量，單位為毫克每百克（mg/100g），i代表7種母

乳低聚糖；

C——試樣測(cè)定液中母乳低聚糖的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL）；

V——初始稀釋體積，單位為毫升（mL）；

DF——添加內(nèi)標(biāo)前任何額外稀釋的稀釋系數(shù)（最終體積/等分試樣體積），單位為毫升

每毫升（mL/mL）；

m——試樣的稱樣量，單位為克（g）；

10——將濃度單位從μg/g換算為mg/100g的換算系數(shù)。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

6.2試樣中母乳低聚糖總量的計(jì)算公式

試樣中母乳低聚糖總量的含量按式（2）計(jì)算

X=X2’-FL+X3-FL+X3’-SL+X6’-SL+XLNnT+XLNT+XDFL………………（2）

式中：

X——試樣中母乳低聚糖的總量，單位為毫克每百克（mg/100g）。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字。

7精密度

在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過算數(shù)平均值的10%。

8其他

本方法的定量限均為10mg/100g。

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