PCR擴(kuò)增和電泳檢測

實(shí)驗(yàn)13DNA片段的PCR擴(kuò)增1、用PCR技術(shù)對(duì)DNA進(jìn)行擴(kuò)增2、用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)擴(kuò)增后的DNA進(jìn)行檢測2021/6/271電泳觀察PCR反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)步驟2021/6/272DNA在體內(nèi)復(fù)制的條件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每條鏈dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：溫和的反應(yīng)條件2021/6/273DNA分子的結(jié)構(gòu)2021/6/274合成DNA分子的原料——脫氧核苷三磷酸2021/6/275合成DNA分子的原料——脫氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP2021/6/276

聚合反應(yīng)機(jī)理：2021/6/277DNA聚合酶2021/6/278不同細(xì)胞的細(xì)胞周期

不同生物細(xì)胞

需要的時(shí)間細(xì)菌一般是20~30分鐘蠶豆根尖細(xì)胞17.3小時(shí)小鼠十二指腸細(xì)胞15.3小時(shí)人的肝細(xì)胞22小時(shí)人的宮頸癌細(xì)胞22.5小時(shí)PCR技術(shù)可在幾小時(shí)內(nèi)，將特定核酸序列擴(kuò)增百萬倍!2021/6/279PCR的概念

PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶鏈反應(yīng)）是指在體外，通過特異DNA引物擴(kuò)增核酸分子中某個(gè)特定區(qū)域的技術(shù)。2021/6/2710

PCR的反應(yīng)體系DNA模板原料：

dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜熱細(xì)菌中分離得到）引物：（單鏈DNA片段）Mg2+（維持酶活性所必需）PCR緩沖液：維持pH，保護(hù)Taq酶

2021/6/2711PCR技術(shù)原理變性退火延伸2021/6/2712PCR三步曲

預(yù)變性保溫變性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃2021/6/2713PCR儀2021/6/2714用于PCR的預(yù)混液（500

L體系）：

ddH2O310

L10×butter50

LMgCl240

LdNTP混合液20L引物125L引物225L模板DNA25L

TaqDNA聚合酶5L

標(biāo)記一個(gè)微量離心管，用取樣器取20

L的預(yù)混液加入到該管中。2021/6/2715反應(yīng)試劑

用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（濃度10μM）1μL引物Ⅱ（濃度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL總體積20μL2021/6/2716微量可調(diào)移液器（一檔吸、二檔排）2021/6/2717PCR反應(yīng)參數(shù)：

變性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s

預(yù)變性94℃300s

保溫72℃600s循環(huán)次數(shù)352021/6/27181、基本概念以瓊脂糖凝膠作為介質(zhì),DNA在外加電場的作用下泳動(dòng)的技術(shù)。2、實(shí)驗(yàn)原理瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。瓊脂糖凝膠電泳2021/6/2719瓊脂糖凝膠電泳基本原理2021/6/27202021/6/2721制膠使用電泳緩沖液在制膠器上配制1.0%的瓊脂糖凝膠?；鞓?μL載樣緩沖液、2μL核酸熒光染料，10μLPCR產(chǎn)物混勻。點(diǎn)樣將上步混好的樣10μL加到凝膠孔中。電泳90V電壓下電泳10~20min。瓊脂糖凝膠電泳的過程2021/6/2722將凝膠倒入制膠器的槽中（60oC）將瓊脂糖加入電泳緩沖液,在微波爐中加熱溶解至透明。制膠2021/6/2723將梳子從制膠槽中拔出

2021/6/2724取出凝膠板放入電泳槽中

向電泳槽中加入電泳緩沖液至沒過凝膠

2021/6/2725

瓊脂糖凝膠電泳中緩沖液的作用1、增加電導(dǎo)率；2、維持電泳過程中的合適的pH。2021/6/2726吸取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10μL。注意吸頭要插入到管底，才能取到PCR產(chǎn)物。

將PCR產(chǎn)物與加樣緩沖液充分混合（吸排幾次）

混樣2021/6/2727常用的上樣緩沖液配方及各成分的作用蔗糖使樣品呈色，便于上樣，形成可見指示帶，預(yù)測電泳進(jìn)程。溴酚藍(lán)增加樣品密度，保證DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)。核酸熒光染料可嵌合入DNA分子，在特定激發(fā)光源的激發(fā)下可發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比。（需要與加樣緩沖液混合）2021/6/2728加樣2021/6/2729進(jìn)行電泳10-20分鐘電泳2021/6/2730實(shí)驗(yàn)用的核酸熒光染料與DNA嵌合后，在DNA圖譜觀察儀的可見光下發(fā)射黃綠色