PH值熒光探針研究

[12]。香豆素類pH熒光探針是一類具有特定結(jié)構(gòu)和熒光性質(zhì)的化學(xué)探針，主要用于檢測和分析溶液的pH值。它們通常具有紫外可激發(fā)的藍(lán)色熒光特性，其熒光強度或波長隨pH值的變化而發(fā)生變化，因此可以通過觀察熒光信號的變化來推斷溶液的pH值。香豆素類pH熒光探針在化學(xué)、生物和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。例如，在生物學(xué)研究中，它們可以用于實時監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的pH變化。Liu等人在2013年開發(fā)了基于香豆素的含有苯并噻唑基團的近紅外pH熒光探針5REF_Ref7839\r\h[13]，該探針在酸性條件下具有光學(xué)響應(yīng)，能在pH為1.5-7.0的范圍內(nèi)進行監(jiān)測，并且具有快速響應(yīng)的能力。圖8探針5響應(yīng)pH的機理2018年，王鵬飛等人將香豆素酸乙酯引入到熒光素中，得到了香豆素與熒光素融合的熒光探針6（圖9）REF_Ref7930\r\h[14]。該探針具有優(yōu)良的光學(xué)性能，具有良好的細(xì)胞膜通透性和低毒性，能夠快速監(jiān)測活細(xì)胞中pH的變化。圖9探針6結(jié)構(gòu)與響應(yīng)機理圖在2020年，T.HienNguyen等人設(shè)計了具有咪唑基的新型科聚合香豆素類化合物REF_Ref8022\r\h[15]，乙烯基芐胺基咪唑甲基香豆素（VIC）、丙烯酰胺基咪唑甲基香豆素（AIC）和苯乙基咪唑甲基香豆素（SIC）(如圖10所示)這些探針在堿性范圍內(nèi)對pH值由熒光響應(yīng)，而隨著pH的則更加，這些所有的香豆素類化合物的熒光強度均有明顯降低，這些探針在pH范圍為10.5-13.5由響應(yīng)，因此可用于檢測各種堿性介質(zhì)中的pH值。圖10探針VIC、AIC和SIC結(jié)構(gòu)與響應(yīng)機理圖1.4論文的創(chuàng)新性本論文在pH熒光探針研究領(lǐng)域取得了比較創(chuàng)新的成果。首先，成功設(shè)計并合成了一種新型pH熒光探針HBD，該探針具有更高的靈敏度和更寬的pH響應(yīng)范圍，為細(xì)胞內(nèi)和組織內(nèi)pH值的精確測量提供了有力工具。此外，本論文深入探討了熒光探針與pH值相互作用的機制，為熒光探針的設(shè)計和優(yōu)化提供了理論支持。綜上所述，本論文在熒光探針的設(shè)計、應(yīng)用和作用機制等方面均取得了創(chuàng)新性進展，為相關(guān)領(lǐng)域的研究和發(fā)展有一定的貢獻。2實驗部分2.1目標(biāo)分子的合成路線設(shè)計圖11探針HBD-1的合成路線圖2.2實驗儀器和試劑表1實驗試劑試劑名稱試劑純度出產(chǎn)公司乙酰丙酮分析純（AR）上海阿拉丁生化科技股份有限公司4-叔丁基-2，6-二甲?；椒臃治黾儯ˋR）薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司氯仿分析純（AR）西隴科學(xué)股份有限公司乙醇分析純（AR）西隴科學(xué)股份有限公司哌啶分析純（AR）廣州化學(xué)試劑廠四氫呋喃分析純（AR）廣州化學(xué)試劑廠2-氨基苯酚分析純（AR）上海阿拉丁生化科技股份有限公司2，3-二氯-5，6二氰-1，4-苯醌分析純（AR）安徽澤升科技有限公司表SEQ表\*ARABIC2實驗儀器儀器名稱出產(chǎn)公司HitachiF-700型熒光光譜日本Hitachi公司Bruker-400型核磁共振波譜儀德國Bruker公司BrukeresquireHCT型質(zhì)譜儀德國Bruker公司ZF-90型多功能紫外暗箱透射儀上海安瑞自動化儀器儀表有限公司81-2型恒溫磁力攪拌器上海斯勒儀器有限公司SHZ-Ш型循環(huán)水式真空水泵鞏義市峪華儀器廠AR1230型電子天平上海菁海儀器有限公司2.3目標(biāo)產(chǎn)物的合成及表征4-叔丁基-2,6-二甲?；椒樱?03mg，0.5mmol）和乙酰丙酮（100mg，1mmol）在哌啶和氯仿的條件下生成了產(chǎn)物HBD，濃縮溶劑后，產(chǎn)生黃色固體，之后將產(chǎn)物進行抽濾處理，得到大量含雜質(zhì)的物質(zhì)，再加入乙醇對產(chǎn)物進行洗滌，洗滌完后再用水進行再次洗滌、干燥，最后得到純的產(chǎn)物HBD。HPD1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.80(d,J=20.6Hz,2H),7.61(s,1H),7.26(s,1H),7.17(s,1H),2.40(s,6H),2.22(s,3H),1.88(s,3H),1.24(s,9H).13CNMR(101MHz,CDCl3)δ210.43(s),202.12(s),201.63(s),154.66(s),148.47(s),147.62(s),139.57(s),139.37(s),133.62(s),125.86–125.68(m),125.41(d,J=48.4Hz),103.99(s),39.27(s),36.55(s),36.12(s),32.32(d,J=23.0Hz),31.71(s),31.71–31.50(m).將HBD的核磁管中加入適量的Na2CO3后隔絕空氣，經(jīng)1HNMR測試，此產(chǎn)物為HBD-1，因其活性太高，沒有得到大量產(chǎn)物。1HNMR(400MHz,DMSO)δ7.83(s,2H),7.33(s,2H),2.37(s,6H),2.09(s,6H),1.19(s,9H).圖12產(chǎn)物HBD在陽光下（A）和熒光照射下（B）顯現(xiàn)的顏色圖片3結(jié)果與討論3.1產(chǎn)物HBD結(jié)構(gòu)分析論文中采用核磁共振質(zhì)譜儀和質(zhì)譜儀檢測產(chǎn)物HBD的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖4-1為產(chǎn)物HBD的氫譜圖，其中在1.24-2.40ppm處呈現(xiàn)出多重峰，7.17-7.61ppm處呈現(xiàn)出單峰，7.80ppm處呈現(xiàn)出雙重峰，可發(fā)現(xiàn)有26個氫。由產(chǎn)物HBD的結(jié)構(gòu)分析可知，這些氫分別來自苯環(huán)和碳鏈，且其氫峰已被明確確認(rèn)。進一步計算表明，這26個氫的數(shù)量與產(chǎn)物HBD中氫原子總數(shù)相符。加堿后，在堿性條件下，HBD經(jīng)歷了開環(huán)變化，其氫的數(shù)量減少了一個，這一變化在附錄中的圖4-2中展示。此時，開環(huán)化合物中氫的數(shù)目下降到25個，表明開環(huán)變化已經(jīng)成功發(fā)生。緊接著，對HBD的產(chǎn)物碳數(shù)進行分析，附錄的圖4-3呈現(xiàn)了其碳譜圖。通過分析，發(fā)現(xiàn)該化合物中含有22個碳，這一結(jié)果與HBD產(chǎn)物中預(yù)期的碳數(shù)一致，有力地證明了該化合物的準(zhǔn)確性。為進一步的研究，我們對HBD產(chǎn)物進行了質(zhì)譜分析。離子峰分析計算的結(jié)果如附錄中的圖4-4所示，該化合物的相對分子質(zhì)量為369.17。與理論預(yù)測值相比，此值基本一致，為HBD產(chǎn)物的準(zhǔn)確性提供了進一步的證實。3.2產(chǎn)物聚集誘導(dǎo)發(fā)光性質(zhì)為了驗證探針HBD是否具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性，我們研究了在不同含量PBS（pH=10）和四氫呋喃（THF）的混合溶液中HBD的熒光光譜性質(zhì)。如圖13所示，在THF含水量0%時，也就是在探針?biāo)芤褐?，HBD發(fā)光微弱，在pH=10的緩沖溶液中逐漸增加THF時，溶液熒光強度逐漸增強；當(dāng)溶液中THF含水量40%時，溶液體系中的熒光強度達到最強，后逐漸增加THF的含量，溶液體系的熒光強度不斷地減弱。在pH=10的時候產(chǎn)物HBD中的螺環(huán)已經(jīng)打開，此時水是良性溶劑而四氫呋喃THF是它的不良溶劑，眾所周知，溶解度對分子運動的限制有顯著影響，因此在THF含量增加的時候，分子內(nèi)運動也受到限制，所以出現(xiàn)熒光強度隨著THF含量增加而減弱的現(xiàn)象。因此，產(chǎn)物HBD是具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性(AIE)的熒光探針。圖13產(chǎn)物HBD溶液中THF不同含水量下熒光強度的變化3.3pH測試將少量固體產(chǎn)物HBD溶于四氫呋喃中，配成10mmol/L溶液，取10μL母液，分別加入10mLpH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0的PBS溶液。如圖所示，pH為3.0-5.0的范圍時，HBD在453nm處熒光強度隨著pH的增大而增強；在pH為5.0-11.0的范圍時，熒光強度隨著pH的增大而逐漸減小。并且當(dāng)pH=8時，在628nm處出現(xiàn)了一個新峰，且隨著pH的增加，新峰的熒光強度逐漸增強。因此，探針HBD在堿性環(huán)境下，熒光性能較好。這是由于在酸性條件下，探針HBD的螺環(huán)處于“閉合”狀態(tài)，發(fā)光波長較低，出現(xiàn)藍(lán)色的熒光（圖14）。隨著pH的逐漸升高，氫氧根離子誘導(dǎo)螺環(huán)發(fā)生斷裂，化合物由HBD變?yōu)镠BD-1，出現(xiàn)628nm的發(fā)射峰，熒光顏色變?yōu)槌壬?。圖14紫外激發(fā)下探針HBD的熒光光譜（pH3.0-11.0）圖15紫外下HBD在pH=3.0和11.0的照片取波長的峰值453nm和628nm處地?zé)晒鈴姸壤L制其與pH之間的關(guān)系曲線，如圖16所示，在pH為3.0-5.0的范圍內(nèi)，453nm處的熒光強度迅速增強，而628nm處的熒光強度基本不變。當(dāng)pH在5.0-11.0的范圍內(nèi)，453nm處的熒光強度迅速降低，而628nm處的熒光強度在不斷增強，熒光顏色由淺綠色變?yōu)槌壬?，這是由于在堿性條件下，化合物HBD開環(huán)，形成HBD-1。值得注意的是，在pH約為9.5時，453nm與628nm處的熒光強度趨于一致。圖16波長的峰值453nm和628nm處地?zé)晒鈴姸扰cpH之間的關(guān)系4結(jié)論通過一系列實驗，我們驗證了pH熒光探針在環(huán)境監(jiān)測中的可行性和有效性。實驗結(jié)果表明，HBD隨著pH的增加，螺環(huán)打開，變?yōu)镠BD-1，453nm處的熒光強度迅速降低，而628nm處的熒光強度在不斷增強。同時，溶液由藍(lán)色變?yōu)槌壬?，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，能夠?qū)崿F(xiàn)對環(huán)境pH的快速、準(zhǔn)確監(jiān)測,為環(huán)境監(jiān)測提供了一種新的、高效的工具。未來，我們可以進一步優(yōu)化熒光探針的性能，拓展其應(yīng)用范圍，為環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展做出更大的貢獻。

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