白骨壤NAC83和NAC29基因的克隆和功能初探

引言1.1研究背景鹽脅迫，是一種非生物脅迫，在干旱、半干旱土地區(qū)域以及依賴(lài)灌溉系統(tǒng)的農(nóng)業(yè)地帶中尤為顯著。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球的鹽堿地總面積約為9.54億公頃。在中國(guó)，鹽堿地面積達(dá)到了9913萬(wàn)公頃，反映出中國(guó)鹽堿地問(wèn)題的普遍性和嚴(yán)重性。鹽堿地是指由鹽成土構(gòu)成，土壤所含鹽分影響到作物正常生長(zhǎng)[1]。隨著人類(lèi)活動(dòng)的加劇和全球的氣候變暖，生態(tài)環(huán)境遭受到了嚴(yán)重的破壞，從而使土地鹽堿化日益嚴(yán)重。鹽脅迫主要通過(guò)滲透脅迫、離子脅迫以及高鹽引起的營(yíng)養(yǎng)缺陷等一系列的次生脅迫對(duì)植物造成危害以至于植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到抑制[1]。因此，了解植物耐鹽性的同時(shí)，研究怎么提高植物的抗逆性是十分重要的[2]。為了解決植物鹽脅迫這一類(lèi)問(wèn)題，我們可以鑒定植物耐鹽基因、通過(guò)基因工程手段提高植物的耐鹽性能，有效改善植物鹽脅迫和鹽堿地土壤利用問(wèn)題是提高鹽堿地利用率的有效方法?；虮磉_(dá)調(diào)控是植物適應(yīng)外部環(huán)境的基礎(chǔ)，也是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵[3]。植物在面對(duì)鹽脅迫的嚴(yán)酷挑戰(zhàn)時(shí)，體內(nèi)起著關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子能夠感應(yīng)環(huán)境中鹽分的濃度變化，迅速響應(yīng)。通過(guò)調(diào)控基因表達(dá)而形成了一套響應(yīng)調(diào)節(jié)機(jī)制，以應(yīng)對(duì)非生物脅迫。NAC家族成員在植物非生物脅迫反應(yīng)中擔(dān)任了非常重要的角色[3]。隨著研究的發(fā)展，該家族的許多基因已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆、葡萄、番茄等物種中發(fā)現(xiàn)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，在大豆中部分NAC基因參與了鹽脅迫響應(yīng)反應(yīng)，例如，NAC181通過(guò)直接調(diào)控大豆中NINa表達(dá)，促進(jìn)共生結(jié)瘤和耐鹽性[6]；在擬南芥經(jīng)過(guò)鹽脅迫誘導(dǎo)后，研究者發(fā)現(xiàn)AtNAC40突變導(dǎo)致其種子萌發(fā)率升高[7]；在辣椒耐鹽材料中，CaNAC36在根和莖的部分表達(dá)量有顯著地提高。經(jīng)過(guò)深入分析，研究者推測(cè)CaNAC36轉(zhuǎn)錄因子在鹽脅迫初期感知發(fā)揮了關(guān)鍵的作用，這類(lèi)基因不僅能夠感知到鹽環(huán)境地變化，還能迅速地將鹽信號(hào)進(jìn)行傳遞并且調(diào)控相關(guān)的耐鹽基因應(yīng)答[8]。水稻中有40個(gè)NAC家族成員在鹽脅迫的響應(yīng)反應(yīng)過(guò)程中，調(diào)控大量脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。然而，在鹽生植物白骨壤中，NAC轉(zhuǎn)錄因子未被鑒定，功能也未被闡明。白骨壤（Avicenniamarina

)，學(xué)名海欖雌，是分布在熱帶亞熱帶海岸潮間帶的泌鹽性紅樹(shù)植物[9]，其葉片或莖表皮細(xì)胞可分化成鹽腺，將體內(nèi)過(guò)剩的鹽分排除，保持植物體內(nèi)鹽含量較低的狀態(tài)，植物受鹽脅迫的危害就可以得到減輕[10]，在長(zhǎng)期受到低溫、高鹽、淹水、土壤缺氧和潮水沖擊等諸多惡劣因素的影響下，白骨壤在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了一系列適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)不良因素[11]，其中包括了形態(tài)結(jié)構(gòu)、水分、光合作用、蒸騰作用、氣孔導(dǎo)度等[12]。然而，白骨壤耐鹽基因極少被鑒定、其耐鹽分子機(jī)理仍有待闡明。目前，NAC家族基因在白骨壤逆境脅迫反應(yīng)中的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道，紅樹(shù)植物NAC家族成員功能研究工作目前較為缺乏。白骨壤基因組數(shù)據(jù)的公開(kāi)發(fā)表以及耐鹽基因家族的初步鑒定，為我們開(kāi)展基因功能研究提供良好的數(shù)據(jù)支持[13]，在前期研究工作中，我們已經(jīng)完成了白骨壤NAC基因家族成員全基因組水平上的鑒定，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，該家族的成員基因在根、莖和葉等部位進(jìn)行了表達(dá)，并且多個(gè)家族基因響應(yīng)了鹽脅迫處理。前期研究發(fā)現(xiàn)（圖1-1A、圖1-1B），在鹽脅迫處理白骨壤條件下，AmNAC29和AmNAC83在白骨壤的葉片和根部組織中表達(dá)，說(shuō)明該基因可能參與了白骨壤鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程。本項(xiàng)目主要工作擬在前期工作的基礎(chǔ)上，通過(guò)克隆已鑒定為有耐鹽功能的基因，載體構(gòu)建、擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化等技術(shù)進(jìn)一步探究其功能明確其在紅樹(shù)植物生長(zhǎng)發(fā)育及鹽脅迫響應(yīng)過(guò)程中的作用、闡明其耐鹽調(diào)控機(jī)制，為我國(guó)抗逆育種工程及沿海生態(tài)環(huán)境的修復(fù)提供理論基礎(chǔ)依據(jù)。圖1-1A：AmNAC基因鹽脅迫響應(yīng)模式分析B:AmNAC基因組織表達(dá)模式分析1.2技術(shù)路線2方法與材料2.1材料本研究選擇在潮灘繁育的三月齡的白骨壤幼苗，再移栽至營(yíng)養(yǎng)土，給白骨壤幼苗澆灌淡水，在溫室內(nèi)（25-30℃、12小時(shí)光照、12小時(shí)黑暗）恢復(fù)一周。將白骨壤幼苗實(shí)驗(yàn)組分別浸沒(méi)在含0mM、500mMNaCl的蒸餾水中，每個(gè)處理設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別在處理0h，6h，12h，24h和48h取葉片，液氮速凍備用。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1RNA的提取及cDNA的獲得用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，中國(guó))提取白骨壤地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼葉、成熟葉、老葉、成熟果、幼果、花的RNA，操作流程按說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行白骨壤各器官RNA提取實(shí)驗(yàn)，具體方法如以下步驟：勻漿處理:50-100mg白骨壤各個(gè)器官剪碎后在液氮中快速研磨成粉末狀態(tài)，加入1mLRNAZol溶液，讓RNAZol溶液與白骨壤在液氮中研磨成粉末狀的各個(gè)器官充分混勻；利用渦旋儀進(jìn)行渦旋，劇烈震蕩；離心后吸取上清；加入氯仿后蓋上管蓋，進(jìn)行震蕩；在4℃，離心后，吸取水樣層加入異丙醇溶液，蓋上管蓋后手腕輕柔畫(huà)八字混勻，在室溫下靜置；在4℃，離心后丟棄上清液；吸取上清液；加入乙醇溶液洗滌RNA沉淀；在4℃，離心后丟棄上清液，在室內(nèi)溫度放置3min，直到RNA晾干后加入Rnasefreewater，得到的RNA在-70℃冰箱保存。經(jīng)濃度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶大小正確后，用于cDNA反轉(zhuǎn)錄。使用TransScriptOne-StepgDNARemovalandcDNASynthesisSuperMix試劑盒（全式金，北京)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以獲得cDNA操作流程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。方法如下：第一條cDNA合成和gDNA去除，反應(yīng)體系在表2-1中列出；輕輕混勻后，42℃孵育30min；85℃加熱5s失活TransScriptRT/RI與gDNARemover。使用內(nèi)參引物，以cDNA作為模板進(jìn)行PCR，PCR反應(yīng)體系如表2-2，PCR反應(yīng)程序如表2-3。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，判斷cDNA目的條帶是否能用于后續(xù)的AmNAC29和AmNAC83基因的組織表達(dá)模式分析實(shí)驗(yàn)。表2-1白骨壤不同組織RNA反轉(zhuǎn)錄獲得第一條cDNA合成和去除gDNA反應(yīng)體系試劑用量2×TSReactionMix10μLTransScriptRT/RIEnzymeMix1μLgDNARemover1μLAnchoredOligo(dT)18primer(0.5μg/μL)1μLTotalRNA/mRNA5μLRNase-freeWater補(bǔ)足至20μL2-2驗(yàn)證白骨壤不同組織cDNA反應(yīng)體系試劑用量2×magicGreenTaqSuperMix5μLTemplatecDNA1μLPrimerF0.5μLPrimerR0.5μLddH2OUpto10μL2-3驗(yàn)證白骨壤不同組織cDNA反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸95℃95℃58℃72℃72℃3min10s10s35cycles20s5min2.2.2AmNAC29和AmNAC83基因的組織表達(dá)模式分析分別以AmNAC29和AmNAC83基因編碼序列為模板設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)定量PCR特異性引物，以白骨壤的地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼葉、成熟葉、老葉、成熟果、幼果、花的cDNA為模板，使用ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR），qPCR反應(yīng)體系如下：2×ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix*10μL，目的基因正、反方向引物各0.5μL，滅菌水8μL，白骨壤不同部位cDNA1μL，檢測(cè)目的基因在白骨壤不同部位的表達(dá)情況。每個(gè)組織樣品設(shè)置三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序如表2-4所示：表2-4AmNAC29和AmNAC83基因組織表達(dá)模式分析的反應(yīng)程序程序名稱(chēng)溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)Stage1預(yù)變性95℃2min1Stage2循環(huán)反應(yīng)95℃60℃72℃10s10s25s4095℃10sStage3溶解曲線65℃1min195℃Stage4冷卻40℃30s1數(shù)據(jù)處理方法：將qPCR得到的CP值使用Excel表格打開(kāi)，求內(nèi)參基因?yàn)橐锵掳坠侨啦煌M織的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)CP值的平均值；用目的基因的CP值減去相對(duì)應(yīng)白骨壤不同組織內(nèi)參基因CP平均值可以得到Δcp=目的基因cp-內(nèi)參基因cp均值；選對(duì)照組，用不同組織的三個(gè)生物學(xué)重復(fù)ΔCP值減去對(duì)照組ΔCP值得到ΔΔCP值；對(duì)不同組織三個(gè)生物學(xué)重復(fù)ΔΔcp值求2-ΔΔct；得到2-ΔΔct，求mean2-ΔΔct相對(duì)表達(dá)量值；求不同組織三個(gè)生物學(xué)重復(fù)ΔΔCP值的誤差；將數(shù)據(jù)用柱狀圖表示。2.2.3白骨壤AmNAC29和AmNAC83的克隆進(jìn)一步探究AmNAC29和AmNAC83的生物學(xué)功能。根據(jù)這兩個(gè)基因的編碼序列，用軟件Primerpremier5設(shè)計(jì)特異性全長(zhǎng)擴(kuò)增引物(表2-5）。提取白骨壤根部的RNA，用得到的RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，提取方法如2.2.2提取白骨壤各器官的RNA和cDNA方法相同。用2×MagicGreenTaqSuperMix試劑盒（吐露港，中國(guó)）設(shè)置62.5℃、61.9℃、61℃、59.6℃、57.9℃梯度退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，操作流程按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。AmNAC29、AmNAC83PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表2-6、表2-7所示，反應(yīng)程序如表2-8所示。表2-5AmNAC29和AmNAC83基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物序列基因名稱(chēng)基因ID引物序列（5'-3'）AmNAC29AM14G136FATTTGCACAGATTGTGAGTAATCCRCCAGAAGTTGGGACATTGAGGAmNAC83AM11G813FTTCATTTGCTCACATTGGCACRTTCAGAATCTGCGAGATCGAGT表2-6驗(yàn)證AmNAC29基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物反應(yīng)體系試劑用量2×phataMaxMasterMix5μLAmNAC29-R0.5μLAmNAC29-F0.5μLcDNA1μLddH2O3μL表2-7驗(yàn)證AmNAC83基因全長(zhǎng)擴(kuò)增引物反應(yīng)體系試劑用量2×phataMaxMasterMix5μLAmNAC83-R0.5μLAmNAC83-F0.5μLcDNA1μLddH2O3μL表2-8AmNAC29和AmNAC83基因全長(zhǎng)擴(kuò)增PCR反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸95℃95℃55-62.5℃72℃72℃3min15s15s30cycles1min10s5minPCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小，正確后繼續(xù)使用高保真酶進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系如表2-9、2-10所示，反應(yīng)程序如表2-11所示。表2-9高保真酶對(duì)AmNAC29基因全長(zhǎng)擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑用量2×phataMaxMasterMix25μLAmNAC29-R2μLAmNAC29-F2μLcDNA3μLddH2O18μL表2-10高保真酶對(duì)AmNAC83基因全長(zhǎng)擴(kuò)增反應(yīng)體系試劑用量2×phataMaxMasterMix25μLAmNAC83-R2μLAmNAC83-F2μLcDNA3μLddH2O18μL表2-11高保真酶對(duì)AmNAC29和AmNAC83基因全長(zhǎng)擴(kuò)增反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸95℃95℃59℃72℃72℃3min15s15s32cycles1min5min將擴(kuò)增產(chǎn)物用EasyPureQuickGelExtractionKitDNA凝膠快速純化試劑盒進(jìn)行濃度為1.5%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)目的基因的長(zhǎng)度。跑膠結(jié)束后對(duì)目的條帶進(jìn)行切膠回收，方法如下：1.用刀片對(duì)目的DNA條帶進(jìn)行切割，放入干凈的離心管中稱(chēng)重；2.向離心管里加入GSB溶液，在水浴鍋中水浴溶解，融化后觀察溶液顏色，可以加入適量的醋酸鈉來(lái)調(diào)整成顏色和GSB溶液顏色相同的黃色；3.加入異丙醇，等凝膠溶液溫度下降后離心；4.加入WB溶液，離心丟棄流出液；再次離心去除殘留的WB溶液；5.打開(kāi)蓋子靜置，讓殘留乙醇溶液得到揮發(fā)，向離心柱正上方加入EB溶液，進(jìn)行離心，洗脫DNA，將洗脫的DNA放置-20℃保存。膠回收產(chǎn)物經(jīng)濃度和純度測(cè)定，-20℃條件下凍存或者用于后續(xù)重組載體的構(gòu)建。2.2.4目的基因片段與表達(dá)載體重組首先從大腸桿菌提取出環(huán)狀質(zhì)粒pBInGlyRED（Red1），對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行酶切制備線性載體，選用的酶是XmaⅠ和EcoRⅠ。構(gòu)建重組的表達(dá)載體35S-AmNAC29-OE和35S-AmNAC83-OE。進(jìn)行酶切制備線性載體反應(yīng)體系如表2-12所示。目的基因與線性載體重組的反應(yīng)體系如表2-13所示。表2-12雙酶切制備線性載體反應(yīng)體系試劑用量10×NEBufferRed1EcoRIXmaIddH2O5μL10μL1μL1μL33μL表2-13膠回收目的基因片段與線性載體重組反應(yīng)體系試劑用量5×CEIIBufferExnaseII線性化載體插入片段ddH2O1μL0.5μL1.5μL2μLto5μL反應(yīng)條件為：在PCR儀上設(shè)置反應(yīng)程序37℃反應(yīng)30min，立即放置于冰上冷卻用于大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。2.2.5大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選膠回收的目的基因與線性載體重組完成后，將重組后的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，方法如下：1.將DH5α感受態(tài)細(xì)胞從冰箱拿出插入冰上，待菌快要融化時(shí)加入膠回收目的基因片段與線性載體重組的產(chǎn)物，蓋上蓋子并用手把離心管輕捏在拇指和食指中，用另一只手的食指輕輕地?fù)艽螂x心管底部，混勻后于冰上靜置30min；2.水浴后取出插到冰上靜置；3.向離心管中加入液體培養(yǎng)基，離心后在溫度為37℃中復(fù)蘇60min；4.離心收菌，吸取上清液留取200μL上清液，涂布到培養(yǎng)基上；5.培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱倒置過(guò)夜培養(yǎng)3-4天。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后，用于后續(xù)的陽(yáng)性克隆的篩選工作。篩選方法如下：1.將過(guò)夜培養(yǎng)的培養(yǎng)基取出，挑單菌落；2.將挑出的單菌在含有LB液體培養(yǎng)基的離心管中轉(zhuǎn)圈吹打；3.將離心管蓋上蓋子后，纏上封口膜放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；4.取菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證是否含有目的基因，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如表2-14所示；PCR反應(yīng)程序如表2-15所示。表2-14大腸桿菌菌液PCR鑒定反應(yīng)體系試劑用量2×MagicGreenTaqSuperMixRED3-FRED3-R模板ddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL3μL表2-15大腸桿菌菌液PCR鑒定反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸95℃95℃56℃72℃72℃3min10s10s35cycles1min15s5min將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，如結(jié)果有目的條帶并且條帶大小正確，則搖菌，提質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果正確后則可送去測(cè)序。序列正確的菌液加入等體積50%的甘油，放在-80℃冰箱保存。2.2.6大腸桿菌質(zhì)粒的提取及鑒定將含有目的基因的大腸桿菌經(jīng)過(guò)挑菌、搖菌后使用質(zhì)粒小提試劑盒按照說(shuō)明書(shū)提取質(zhì)粒具體實(shí)驗(yàn)方法步驟如下：向吸附柱CP3加入BL平衡液；離心把收集到的廢液丟棄；把過(guò)夜培養(yǎng)的菌液加到離心管中，離心后丟棄上清物；在留有菌塊沉淀的離心管中加入溶液P1，用渦旋儀把細(xì)菌沉淀懸浮加入溶液P2后加入溶液P3溫和混勻，進(jìn)行離心；把步驟三收集到的上清液吸取到吸附柱CP3中，離心；加入漂洗液PW進(jìn)行離心，丟棄廢液；接著再次離心除去殘留的漂洗液，打開(kāi)蓋子待殘留的漂洗液晾干向吸附柱膜的中間加入洗脫液EB，室溫下放置后，離心把質(zhì)粒溶液收集到離心管。獲得的質(zhì)粒溶液經(jīng)濃度檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)條帶大小，測(cè)序正確則可用于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化。2.2.7農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選將驗(yàn)證后的質(zhì)粒與農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，方法如下：把農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞從冰箱中取出放在冰上融化；向含有感受態(tài)細(xì)胞離心管里加入質(zhì)粒，輕輕混勻；混勻之后按先后順序分別在冰上，液氮和水浴鍋各靜置5min；向離心管加入液體LB培養(yǎng)基；培養(yǎng)6h后，進(jìn)行離心保留200μL上清液，混勻涂布到LB培養(yǎng)基上，避光倒置培養(yǎng)3天。培養(yǎng)結(jié)束后，進(jìn)行菌落PCR，反應(yīng)體系如表2-16所示，反應(yīng)程序如表2-17所示。表2-16農(nóng)桿菌菌落PCR反應(yīng)體系試劑用量2×MagicGreenTaqSuperMixRED3-FRED3-R模板（菌液）ddH2O5μL0.5μL0.5μL1μL3μL表2-17農(nóng)桿菌菌落PCR鑒定反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸95℃95℃58℃72℃72℃5min30s20s30cycles1min30s10min經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后條帶大小正確，進(jìn)行搖菌，保菌工作。將保的菌進(jìn)行畫(huà)線培養(yǎng)、挑菌、搖菌工作，用于后續(xù)的野生型擬南芥浸染實(shí)驗(yàn)。2.2.8擬南芥種植及花序浸染擬南芥種植方法：把營(yíng)養(yǎng)土與蛭石按照3：1的比例混合均勻裝入小盆中填裝時(shí)注意不要將土壓的太緊，在種植前需要將種子春化4天，保證種子一致。將春化好的種子播撒在土壤上，蓋上一層較薄保鮮膜，保證濕度。在大約一周至半月左右長(zhǎng)出3-4片葉后去除薄膜。澆水時(shí)用營(yíng)養(yǎng)液噴灑在表面。室內(nèi)培養(yǎng)溫度為18-24℃?；ㄐ蚪荆涸诮厩?，需要挑取劃線培養(yǎng)的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞單菌落，進(jìn)行搖菌。每個(gè)培養(yǎng)基挑取兩個(gè)單菌落進(jìn)行搖小擴(kuò)增，每個(gè)培養(yǎng)基小搖的菌液選取一瓶進(jìn)行大搖擴(kuò)增后加入蔗糖懸浮液。制備完成后，用于野生型擬南芥的浸染具體方法如下：1.劃線培養(yǎng)：每個(gè)基因劃兩個(gè)含有抗生素培養(yǎng)基，28℃避光培養(yǎng)3天；2.每個(gè)培養(yǎng)基挑取兩個(gè)單菌落進(jìn)行搖菌，挑取后放到含有無(wú)菌水的離心管中混勻，加入LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18h后于4℃冰箱保存；3.每個(gè)培養(yǎng)基小搖的菌液選取一個(gè)進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，把小搖后的菌液加到LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10h后，檢測(cè)OD600值。將大搖后的菌液離心后倒掉上清液。4.離心管中加入提前配好的蔗糖懸浮液吹打混勻，倒入浸染容器中再加入適量的懸浮液使OD值保持在0.4-0.6之間。5.將花序全部浸入菌液1min左右后取出，用不透光盒子罩住避光培養(yǎng)10h后揭開(kāi)蓋子?；ㄐ蚪久扛?天重復(fù)一次。重復(fù)4次花序浸染即可。浸染結(jié)束后得到T0代擬南芥株系。2.2.9擬南芥陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的篩選應(yīng)用花序浸染法獲得擬南芥T0代株系。T0代擬南芥收獲的種子用75%乙醇消毒后，春化4天左右，春化結(jié)束后，將種子用移液槍吸取平鋪在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基上萌發(fā)，因?yàn)橘|(zhì)粒pBInGlyRED含有編碼紅色熒光蛋白的基因片段，在鹵素?zé)粽丈湎玛?yáng)性幼苗葉片會(huì)顯示紅色，選取葉片為紅色的幼苗移入土壤中，待長(zhǎng)大后采取轉(zhuǎn)化后的T1擬南芥株系葉片，使用TransDirectPlantTissuePCRKit植物組織直接PCR試劑盒提取DNA進(jìn)行陽(yáng)性鑒定；提取DNA反應(yīng)體系如表2-18所示，PCR反應(yīng)程序如表2-19所示。表2-18陽(yáng)性鑒定PCR反應(yīng)體系試劑用量2×TransDirectSuperMixForward-FReverse-R模板（菌液）ddH2O5μL0.2μL0.2μL2μL2.6μL表2-19陽(yáng)性鑒定PCR反應(yīng)程序組分溫度時(shí)間預(yù)變性變性退火延伸終延伸94℃94℃56℃72℃72℃10min30s30s36cycles1min10s8min3結(jié)果與分析3.1RNA的提取及cDNA的獲得使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(天根，中國(guó))提取白骨壤地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼葉、成熟葉、老葉、成熟果、幼果、花的RNA，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3-1所示。圖3-1白骨壤不同器官RNA瓊脂糖凝膠電泳注：1：白骨壤的花；2：成熟果；3：幼果；4：幼葉；5：成熟葉；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，沒(méi)有出現(xiàn)5SrRNA條帶，RNA提取質(zhì)量較高，可以用于后續(xù)的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。圖3-2白骨壤不同器官cDNA的驗(yàn)證注：1：白骨壤的花；2：成熟果；3：幼果；4：幼葉；5：成熟葉；6：老葉；7：幼根；8：地下呼吸根；9：地上呼吸根將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，內(nèi)參基因?yàn)橐镞M(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，條帶大小正確，證明cDNA質(zhì)量較好可用于白骨壤組織表達(dá)模式分析。3.2AmNAC29和AmNAC83基因的組織表達(dá)模式分析以AmNAC29、AmNAC83基因序列為模板設(shè)計(jì)定量PCR特異性引物，以白骨壤的地上呼吸根、地下呼吸根、幼根、幼葉、成熟葉、老葉、成熟果、幼果、花的cDNA為模板，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，檢測(cè)目的基因AmNAC29、AmNAC83在白骨壤不同部位的表達(dá)情況。結(jié)果表示，AmNAC29和AmNAC83基因在老葉中表達(dá)量最高，其次AmNAC29基因在地下呼吸根、幼根和成熟葉中表達(dá)量比地上呼吸根、幼葉、成熟果和幼果高，結(jié)果如圖3-3所示。AmNAC83在地下呼吸根、幼根和花中表達(dá)量比成熟果、幼果和幼葉、成熟葉高，結(jié)果如圖3-4所示。圖3-3AmNAC29基因在白骨壤各個(gè)器官中的相對(duì)表達(dá)量圖3-4AmNAC83基因在白骨壤各個(gè)器官中的相對(duì)表達(dá)量3.3白骨壤AmNAC29和AmNAC83的克隆用2×MagicGreenTaqSuperMix試劑盒（吐露港，中國(guó)）驗(yàn)證AmNAC29、AmNAC83全長(zhǎng)基因克隆引物，設(shè)置62.5℃、61.9℃、61℃、59.6℃、57.9℃梯度退火溫度，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果如圖3-5所示，AmNAC29、AmNAC83兩個(gè)基因的引物條帶在61.9℃和62.5℃兩個(gè)退火溫度比較明亮，可以繼續(xù)用高保真酶進(jìn)行全長(zhǎng)基因克隆。圖3-5白骨壤AmNAC29、AmNAC83基因克隆引物瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證注：M:Marker；29：AmNAC29基因全長(zhǎng)基因克隆引物；83：AmNAC83基因全長(zhǎng)基因克隆引物將AmNAC29、AmNAC83特異性引物繼續(xù)擴(kuò)增。通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，如圖3-6所示。結(jié)果表明PCR產(chǎn)物與目的基因長(zhǎng)度基本一致，可以進(jìn)行切膠，純化回收。圖3-6AmNAC29、AmNAC83基因全長(zhǎng)引物PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳注：M：Marker；29：AmNAC29；83：AmNAC833.4目的基因片段與表達(dá)載體重組目的基因片段與表達(dá)載體重組選用的載體為pBInGlyRED，如圖3-7所示。通過(guò)無(wú)縫克隆的方法將純化后的PCR產(chǎn)物克隆進(jìn)pBInGlyRED線性載體中，得到35S-AmNAC29-OE和35S-AmNAC83-OE的表達(dá)載體。陽(yáng)性細(xì)菌克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)。圖3-7pBInGlyRED質(zhì)粒圖3.5大腸桿菌的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性克隆的篩選將重組的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)夜培養(yǎng)后菌液PCR，檢測(cè)表達(dá)載體是否已轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，AmNAC29基因大腸桿菌菌液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3-8所示。AmNAC83基因大腸桿菌菌液瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3-9所示。圖3-8AmNAC29基因大腸桿菌菌液PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖3-9AmNAC83基因大腸桿菌菌液PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，重組的表達(dá)載體已轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，選取三個(gè)條帶明亮的菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)及重組質(zhì)粒的。3.6大腸桿菌質(zhì)粒的提取及鑒定將含有重組載體的大腸桿菌提取質(zhì)粒，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖3-10所示。圖3-10AmNAC29、AmNAC83質(zhì)粒瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，條帶大小正確，質(zhì)?？梢杂糜诤罄m(xù)的農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。3.7農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101的轉(zhuǎn)化及陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選將提取的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，進(jìn)行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，將含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌落PCR，檢測(cè)質(zhì)粒是否已成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。AmNAC29菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如圖3-11、3-12所示，AmNAC83菌落PCR擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果如圖3-13所示。圖3-11AmNAC29基因農(nóng)桿菌菌落PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖3-12AmNAC29基因農(nóng)桿菌菌落PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖3-13AmNAC83基因農(nóng)桿菌菌落PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳從上述的瓊脂糖凝膠電泳圖可以看到，重組的質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌，可以進(jìn)行后續(xù)的野生型擬南芥浸染實(shí)驗(yàn)。3.8擬南芥種植及花序浸染將含有質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，每個(gè)基因的培養(yǎng)基挑取兩個(gè)菌落進(jìn)行搖菌，利用花序浸染法，得到轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系。將花序全部浸入菌液1min左右后取出，避光培養(yǎng)10h后轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)?；ㄐ蚪久扛?天重復(fù)一次。浸染結(jié)束后得到T0代擬南芥株系。3.9擬南芥陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系的篩選花序浸染結(jié)束后得到的T0代擬南芥，經(jīng)培養(yǎng)收獲種子進(jìn)行播種，得到轉(zhuǎn)化后的T1擬南芥株系。剪取對(duì)照組野生型擬南芥及T1代轉(zhuǎn)化后的擬南芥葉片提取DNA為模板，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。將T0代擬南芥收獲的種子進(jìn)行播種，經(jīng)培養(yǎng)，一共獲得了20棵T1代AmNAC29基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3-14所示。經(jīng)培養(yǎng)一共獲得了18棵T1代AmNAC83基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)如圖3-15-A和3-15-B所示。圖3-14T1代AmNAC29基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系陽(yáng)性鑒定瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)檢測(cè)，有20株T1代AmNAC29基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系出現(xiàn)條帶，且條帶大小正確為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。圖3-15-AT1代AmNAC83基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥1-12號(hào)株系陽(yáng)性鑒定瓊脂糖凝膠電泳圖3-15-BT1代AmNAC83基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥13-18號(hào)株系陽(yáng)性鑒定瓊脂糖凝膠電泳經(jīng)檢測(cè)，有6株T1代AmNAC83基因轉(zhuǎn)化后的擬南芥株系出現(xiàn)條帶，且條帶大小正確為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。4討論與結(jié)論近年來(lái)，土地鹽漬化是影響植物生長(zhǎng)的原因之一[14]，NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物中的一個(gè)超大的基因家族，因?yàn)槠涠鄻踊慕Y(jié)構(gòu)類(lèi)型，在植物的生長(zhǎng)，生理活動(dòng)、抵御脅迫等不良環(huán)境中幼豐富的調(diào)控功能[15]。尤其在逆境脅迫的調(diào)控時(shí)，起著非常重要的作用[16]。隨著研究的發(fā)展，該家族的許多基因已經(jīng)在擬南芥、水稻、大豆、葡萄、番茄等物種中發(fā)現(xiàn)，但在白骨壤逆境脅迫反應(yīng)中的功能研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，從耐鹽的紅樹(shù)植物種類(lèi)白骨壤中克隆得到了AmNAC29、AmNAC83兩個(gè)基因。通過(guò)基因在器官中的表達(dá)模式分析結(jié)果顯示，AmNAC29基因同樣是在老葉中表達(dá)量最高，表達(dá)量緊跟其后的是在地下呼吸根、幼根和成熟葉這些部位。AmNAC83基因在老葉中表達(dá)量最高，其次是地下呼吸根、幼根和花朵這些器官的表達(dá)量比其他器官高。這兩個(gè)基因在根、葉、花、果實(shí)中的表達(dá)量都存在著非常明顯的差異，根據(jù)表達(dá)模式分析圖可以直觀地看到，這兩個(gè)基因主要是在葉片、根部中表達(dá)，但在果實(shí)和花中的表達(dá)量比葉片、根部要低.推測(cè)AmNAC29、AmNAC83兩個(gè)基因可能主要是在根部和葉片中進(jìn)行表達(dá)，發(fā)揮調(diào)控作用。結(jié)合翟允汝[17]的研究可以知道，在鹽脅迫前，NnNAC35基因的表達(dá)在荷花中各個(gè)器官的表達(dá)量都有顯著的差異，說(shuō)明NAC家族基因可能具有器官表達(dá)特異性。本研究克隆AmNAC29和AmNAC83基因，通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥，在經(jīng)過(guò)培育后獲得了T1代轉(zhuǎn)化后的擬南芥，并篩選獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因擬南芥株系，為后期研究T2代轉(zhuǎn)基因擬南芥株系奠定基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)[1]周振玲.耐鹽性不同水稻品種對(duì)鹽脅迫響應(yīng)的機(jī)制與調(diào)控[D].揚(yáng)州大學(xué),2024.DOI:10.27441/ki.gyzdu.2023.000113.[2]盧海峰.鹽脅迫、干旱脅迫對(duì)紫花苜蓿生長(zhǎng)和生理及葉片氮特征的影響[D].揚(yáng)州大學(xué),2023.DOI:10.27441/ki.gyzdu.2022.001247.[3]宋松波.轉(zhuǎn)錄因子ZmNAC20調(diào)控玉米響應(yīng)干旱脅迫的分子機(jī)制[D].河南農(nóng)業(yè)大學(xué),2024.DOI:10.27117/ki.ghenu.2023.000408.[4