陸生野生脊椎動物種質(zhì)資源樣本采集規(guī)范

3陸生野生脊椎動物種質(zhì)資源樣本采集規(guī)范本規(guī)范規(guī)定了省陸生野生脊椎動物種質(zhì)資源樣本采集規(guī)范，包括采集許可申請、樣本類型、樣本信息數(shù)據(jù)、采集方法、采集程序、臨時保存方式、運輸方式等。本標準適用于省內(nèi)相關(guān)大專院校、研究機構(gòu)、自然保護區(qū)管理機構(gòu)、動物園、野生動物繁育機構(gòu)等，其他機構(gòu)可參照執(zhí)行。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件?！吨腥A人民共和國野生動物保護法》（2022年12月30日）《中華人民共和國自然保護區(qū)條例》（2017年10月7日）《中華人民共和國生物安全法》（2020年10月17日）《全國陸生野生動物資源調(diào)查與監(jiān)測技術(shù)規(guī)程》（國家林業(yè)局，2011年）《陸生野生動物疫源疫病監(jiān)測防控管理辦法》（國家林業(yè)局令2013第31號）LY/T2359-2014陸生野生動物疫源疫病監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本文件。3.1陸生野生脊椎動物terrestrialvertebrate行肺呼吸，主要在陸地生境棲息、捕食或繁育的野生脊椎動物。3.2種質(zhì)資源樣本germplasmresourcessample含有物種全部或部分遺傳信息的DNA、細胞、精液、血液、組織、器官等。能夠中長期保存，用于動物學研究，或用于在未來技術(shù)成熟時恢復(fù)為完整的動物個體。43.3動物組織tissue形態(tài)相同或相似、機能相同或密切相關(guān)的細胞群及其分泌物構(gòu)成的具有一定形態(tài)、能完成一定機能的結(jié)構(gòu)。動物組織一般分為四類：上皮組織、結(jié)締組織、肌肉組織、神經(jīng)組織。3.4組織樣本（DNA樣本）tissuesampleforDNAextraction保存質(zhì)量能夠滿足全基因組（包括線粒體基因組）提取的動物組織。3.5組織樣本（RNA樣本）tissuesampleforRNAextraction保存質(zhì)量能夠滿足RNA提取的動物組織。3.6動物器官organ由幾種不同類型組織有機結(jié)合形成的、具有一定形態(tài)特征和生理機能的結(jié)構(gòu)，如睪丸、卵巢、心臟、肝臟、肺等。4目標與原則規(guī)范陸生野生動物種質(zhì)資源樣本采集工作，為動物學研究、動物保護提供科學保障。4.2原則4.2.1合法性原則野生動物為國家所有。無論出于何種目的采集野生動物或其部分樣本，應(yīng)當具備相應(yīng)條件，符合生物安全管理規(guī)范，符合相關(guān)法律要求，并得到主管部門的許可。4.2.2科學性原則野生動物種質(zhì)資源樣本采集是科學性、專業(yè)性都非常強的工作，必須由專業(yè)人員或經(jīng)過一定專業(yè)培訓的人員，按照一定的科學規(guī)范操作。4.2.3全過程控制原則鑒于大自然中病毒、細菌等微生物無處不在，動物種質(zhì)資源樣本存在被污染風險，因此必須實行全過程控制，從事前準備、樣本采集、臨時保存、運輸過程及保藏，每一步驟均須規(guī)范操作，以保證樣本的純潔性。5采集對象55.1陸生野生脊椎動物類別a.哺乳類；b.鳥類；c.爬行類（淡水龜鱉類除外）5.2種質(zhì)資源樣本類別a.遺傳物質(zhì)（DNA）b.生殖細胞（精液、卵細胞）；c.組織（皮膚、肌肉、血液等d.器官（睪丸、卵巢、心臟等）。6申請許可陸生野生脊椎動物歸屬各級政府林業(yè)主管部門管理，采集陸生野生脊椎動物樣本（包括野外無主動物尸體）均需獲得主管部門的許可。采集國家一級保護野生動物種質(zhì)資源樣本，應(yīng)當向國家林業(yè)主管部門申請許可；采集國家二級保護野生動物種質(zhì)資源樣本，或到國家級自然保護區(qū)采集，應(yīng)當向省級林業(yè)主管部門申請許可；采集有重要生態(tài)、科學、社會價值的陸生野生動物和省級重點保護野生動物種質(zhì)資源樣本，或到省級、縣級自然保護區(qū)采集，應(yīng)當向縣級以上林業(yè)主管部門申請許可。7采集前準備7.1大型儀器設(shè)備包括交通運輸工具（車輛）、車載超低溫冰箱（-80℃)、車載普通冰箱（-20℃)、液氮罐等（見附錄1）。7.2小型器具包括解剖刀、手術(shù)剪、鑷子、凍存管、凍存盒、白大褂、口罩、乳膠手套、脫脂棉、紗布等（見小型器具應(yīng)清洗干凈、充分消毒，分門別類、整齊擺放于專用工具箱中備用。67.3化學試劑RNAlater、RNase抑制劑、無水乙醇、95%乙醇、去離子水等（見附錄3）。化學試劑應(yīng)封裝于專用容器中，分門別類擺放于安全度高的車載專用試劑柜或試劑箱中備用。8采集8.1組織樣本采集8.1.1組織樣本（DNA樣本）根據(jù)采集對象種群數(shù)量情況，同一地區(qū)同一物種挑選1-10個個體。注意同物種樣本的采集地應(yīng)保持一定距離（根據(jù)動物類群活動范圍浮動）。應(yīng)在每支凍存管上做好標記，可用標簽紙標記采集編號（原始編號）粘貼至凍存管上，或用記號筆在凍存管上標記；優(yōu)先選擇肌肉、內(nèi)臟等角質(zhì)化程度低的部位，每個個體采集1份（管）組織材料，每份組織材料約1克（黃豆大?。┲糜趦龃婀軆?nèi)；在每份組織材料的凍存管內(nèi)添加至少5倍體積的無水乙醇完全浸泡；組織材料在2-8℃或更低溫度條件下（冷藏）暫存；組織材料以-20℃（冷凍）或更低溫度盡快運輸至保藏單位，優(yōu)先使用干冰等溫度低的運輸條件。8.1.2組織樣本（RNA樣本）同一地區(qū)同一物種挑選1-3個個體。同物種樣本的采集地應(yīng)保持一定距離（可根據(jù)動物類群活動范圍調(diào)整）。解剖取樣要及時，在動物個體死亡半小時內(nèi)完成解剖采樣。應(yīng)在每支凍存管上做好標記，可用標簽紙標記采集編號（原始編號）粘貼至凍存管上，或用記號筆在凍存管上標記；每個個體各器官（心、肝、脾、肺、腎等）采集3份（管）組織材料，每份組織材料約1克（黃豆大?。┲糜趦龃婀軆?nèi)；在每份組織材料的凍存管內(nèi)添加至少5倍體積的RNAlater保存劑完全浸泡；組織材料在2-8℃條件下冷藏12小時（過夜）；組織材料在-20℃或更低溫度條件下（冷凍）暫存；組織材料以-20℃（冷凍）或更低溫度盡快運輸至保藏單位，優(yōu)先使用干冰等溫度低的運輸條件。8.1.3血液樣本7同一地區(qū)同一物種挑選1-10個個體。注意同物種樣本的采集地應(yīng)保持一定距離（根據(jù)動物類群活動范圍浮動）。應(yīng)在每支采血管上做好標記，可用標簽紙標記采集編號（原始編號）粘貼至凍存管上，或用記號筆在采血管上標記；用抗凝采血管對哺乳動物每個個體采集1-5ml血液，對鳥類動物每個個體采集0.5-1ml血液，采血量可根據(jù)動物個體大小有所調(diào)整；將采血管上下緩慢顛倒混勻；血液樣本在2-8℃條件下（冷藏）暫存；血液樣本在2-8℃（冷藏）條件下盡快運輸至保藏單位；如暫存、運輸時間超過1周，血液樣本應(yīng)在-20℃（冷凍）條件下暫存，并以-20℃（冷凍）或更低溫度盡快運輸至保藏單位，優(yōu)先使用干冰等溫度低的運輸條件，避免因反復(fù)凍融造成血液樣本降解。8.1.4細胞樣本在動物個體死亡半小時內(nèi)完成解剖采樣。野外采集細胞樣本工作量較大，需要專人操作。采樣過程中應(yīng)注意無菌操作，防止樣本污染。每支凍存管上應(yīng)該做好標記，可用標簽紙標記采集編號（原始編號）粘貼至凍存管上，或用記號筆在凍存管上標記；每個個體各器官（心、肝、脾、肺、腎等）采集2-3克組織材料，盡量剔除外層膜及結(jié)締組織；組織材料在75%酒精中浸泡5-10秒；組織材料在1XPBS中清洗3次；組織材料裝于含有DMEM的50ml離心管中，在2-8℃條件下（冷藏）運回實驗室；在實驗室內(nèi)分離培養(yǎng)細胞，每份細胞樣本的細胞數(shù)量不少于1x106個；細胞樣本應(yīng)盡快運輸至保藏單位。8.2樣本信息采集8.2.1數(shù)據(jù)文字信息采集分類學信息8中文種名（中文物種名稱，如“揚子鱷”）拉丁學名（根據(jù)物種命名法規(guī)命名的學名，包括屬名、種本名，如“Alligatorsinensis”）種下名稱（即亞種名，若有則須添加，如“Macacathibetanahuangshanensis”）綱名稱（中文和拉丁文同時填寫）目名稱（中文和拉丁文同時填寫）科名稱（中文和拉丁文同時填寫）采集信息采集號（自行命名，但需確保編碼原則統(tǒng)一性、編碼唯一性，可使用物種簡稱字母+數(shù)字）采集地（填寫具體采集地點，至少描述到行政村級行政單位，如“休寧縣璜尖鄉(xiāng)璜尖村”；若為行車途中采集，須填寫道路名稱和離最近行政村間的距離，如“楊璜線距璜尖村4km處”。地點按照“中國行政區(qū)劃網(wǎng)”（）劃分標準填寫）經(jīng)度（采集地經(jīng)度，采用“度”格式，至少要到小數(shù)點后4位，例：E118.287859）緯度（采集地緯度，采用“度”格式，至少要到小數(shù)點后4位，例：N29.699644）海拔（采集地海拔，保留小數(shù)點后兩位，如128.49m）采集人（標本具體采集人。如無確切采集人，可填單位或項目考察隊、采集隊等等）采集時間（注意規(guī)定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”補齊，之間用“-”連接，如“2022-03-15”）采集方式（直接采集、網(wǎng)捕、燈誘、陷阱等）生境（包括農(nóng)田、森林、濕地、湖泊、河流等，家養(yǎng)動物不填）保存單位（標本保藏單位全稱）標本信息物種鑒定方法（形態(tài)學/分子生物學鑒定）鑒定人（標本鑒定人）鑒定時間（注意規(guī)定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”補齊，之間用“-”連接，如“2023-03-15”）標本號（優(yōu)先使用標本館編號）標本屬性（正模、配模、副模、地模、普通等等）9標本制作日期（注意規(guī)定的日期格式“yyyy-mm-dd”，不足位用“0”補齊，之間用“-”連接，如“2023-03-15”）保藏方式（標本保藏方式，如浸泡、干制、冰凍等等）實物狀態(tài)（標本實物狀態(tài)，如完整、破損等。非完整標本可簡單描述破損部位，如“尾部缺如”）標本保藏單位標本保藏位置（根據(jù)具體情況選擇填寫）標本聯(lián)系人聯(lián)系郵箱組織樣品信息組織類型（可填血液、心、肝、脾、肺、腎、肌肉等）組織樣品采集號（根據(jù)具體情況選填）DNA條碼編號（根據(jù)具體情況選填）共享方式（如完全開放共享、協(xié)議共享、暫不共享等）獲取途徑（標本獲取途徑，如既有、采集、交換、捐贈、罰沒、購買等）聯(lián)系人（包括單位、地址、郵編、電話、電子信箱等）類群特有信息如獸類特有、鳥類特有、爬行類特有，可根據(jù)各類群情況自行增加字段填寫。8.2．2圖像信息采集生境照規(guī)范.1整體要求野生動物生境照要求體現(xiàn)采樣地地貌、植被、水源等，家養(yǎng)動物生境照要求體現(xiàn)飼養(yǎng)環(huán)境、喂食情況等；每個采樣地拍攝1-3張生境照；照片精度要求在1000萬（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式為“jpg”格式。.1命名規(guī)范生境照以“采樣地（省市縣）”+英文半角“-”+阿拉伯數(shù)字“序號”+“.jpg”命名；只有一張照片時：采樣地-1.jpg，如：省黃山市黃山區(qū)-1.jpg有兩張及以上照片時：采樣地-1.jpg、采集地-2.jpg，如：省黃山市黃山區(qū)-1.jpg、省黃山市黃山區(qū)-2.jpg；生境照存于一個文件夾內(nèi)，文件夾按“生境照”格式命名。工作照規(guī)范.1整體要求工作照要求體現(xiàn)工作場景、工作方式等；每個采樣地拍攝1-3張工作照；照片精度要求在1000萬（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式為“jpg”格式。.2命名規(guī)范工作照以“工作內(nèi)容”+英文半角“-”+阿拉伯數(shù)字“序號”+“.jpg”命名；只有一張照片時：工作內(nèi)容-1.jpg，如：采集當?shù)丶茵B(yǎng)動物-1.jpg有兩張及以上照片時：工作內(nèi)容-1.jpg、工作內(nèi)容-2.jpg；工作照存于一個文件夾內(nèi)，文件夾按“工作照”格式命名。標本（個體）照規(guī)范.1整體要求標本應(yīng)拍攝成標本外觀照，活體動物應(yīng)拍攝成個體照；每個動物個體拍攝1-3張全身入鏡照片，主要鑒別特征局部特寫照1-2張；像素大小:照片精度要求在1000萬（2775×3700）像素值以上，以保障照片清晰度，保存格式為“jpg”格式。.2具體要求先拍攝個體對應(yīng)的標簽，再拍攝該個體所有角度照片，這樣便于后期辨識對應(yīng)的照片；活體整體照（背面、背側(cè)面和腹面）需在擺拍造景下完成，其余特寫對背景無特殊要求（最好選擇深色、純色背景，便于后期圖片處理）；擺拍最好在原產(chǎn)地進行，盡可能還原其生境（可選擇林緣開闊區(qū)域或較安全、動物不易逃脫的地方，需若干人配合)；如拍攝需在室內(nèi)完成，擺拍造景需根據(jù)物種生活習性完成；鑒別特征細節(jié)照：光圈要小，景深要淺，形態(tài)細節(jié)特征須清晰。.3命名規(guī)范標本照以“標本號”+英文半角“-”+阿拉伯數(shù)字“序號”+“.jpg”命名；只有一張照片時：標本號-1.jpg，如：660315-1.jpg；有兩張及以上照片時：標本號-1.jpg、標本號-2.jpg、標本號-3.jpg，如：660315-1.jpg、660315-2.jpg、660315-3.jpg；無標本的活體動物照片命名參照標本照執(zhí)行，可用“采集號”代替“標本號”命名。匯交規(guī)范生境照、工作照、標本（個體）照文件夾存于一個文件夾內(nèi)，文件夾以“物種采集地省市縣”命名，如省黃山市休寧縣，同一物種多個采集地的文件夾存于一個文件夾下，以“物種名”命名，同一類群物種存于同一文件夾，以“年份-地點-類群”格式命名，例如“2023-省黃山市徽州區(qū)-鳥類”、“2023-省黃山市歙縣-蛇類”。圖像等大數(shù)據(jù)以U盤、硬盤等形式匯交至保藏單位。9樣本運輸樣本采集完成、存放于臨時保存設(shè)備后，應(yīng)盡快送到保藏機構(gòu)進行長期保存。運送樣本的車輛，應(yīng)經(jīng)過檢查完全正常，證照、保險、安全設(shè)施（包括滅火器等）齊全。樣本保存設(shè)備應(yīng)完全固定，不會因車輛顛簸而位移、傾斜。車輛行駛過程中，應(yīng)盡量選擇質(zhì)量更好的道路。司機連續(xù)駕駛達到兩個小時，則必須休息20分鐘以上。當天駕駛時間不能超過8小時。應(yīng)有專業(yè)人員跟車，定時對樣本保存設(shè)備進行檢查，確保設(shè)備全程正常工作。樣本到達保藏機構(gòu)，應(yīng)第一時間移交，確保以最快速度置入長期保藏設(shè)備。附錄1動物樣本