生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù) 課件 第五章酶學(xué)分析技術(shù)-陳武哲

職業(yè)教育醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)專(zhuān)業(yè)教學(xué)資源庫(kù)生物化學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)第五章酶學(xué)分析技術(shù)BASICCLINICALLABORATORYMEDICINE2目錄酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)1酶活性測(cè)定方法2代謝物酶學(xué)分析技術(shù)酶活性測(cè)定的影響因素診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用同工酶分析3333酶(enzyme)是由活細(xì)胞產(chǎn)生的對(duì)特異底物具有高效催化作用的蛋白質(zhì)，屬于生物催化劑，是臨床酶學(xué)分析技術(shù)的主體。酶的概念第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)酶學(xué)分析的重要內(nèi)容之一是對(duì)酶進(jìn)行測(cè)定，包括酶絕對(duì)質(zhì)量測(cè)定和相對(duì)質(zhì)量（酶活性）測(cè)定兩種方式。酶絕對(duì)質(zhì)量測(cè)定是將酶作為一種蛋白質(zhì)，對(duì)其酶蛋白質(zhì)量進(jìn)行定量測(cè)定的方法酶活性測(cè)定（相對(duì)質(zhì)量）是將酶作為一種催化劑，對(duì)其催化反應(yīng)速率進(jìn)行定量，以間接代表酶含量的測(cè)定方法。臨床上廣泛采用酶活性測(cè)定用于間接表示酶的含量一、酶測(cè)定的基礎(chǔ)知識(shí)（一）酶活性的概念指在規(guī)定條件下，單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量即酶促反應(yīng)的速度。

V=Δ[P]/t或-Δ[S]/t第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)底物濃度為〔S〕,產(chǎn)物濃度為〔P〕,時(shí)間為t，反應(yīng)速度為v注：在實(shí)際測(cè)定酶促反應(yīng)速度時(shí)，以測(cè)定單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量為好。

第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)（二）酶活性單位定義：指在一定條件下使酶促反應(yīng)達(dá)到某一速度時(shí)所需要的酶量。酶活性單位是一個(gè)人為規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)。慣用單位：酶活性測(cè)定方法的建立者所規(guī)定的單位。（極少用）國(guó)際單位：1IU指在規(guī)定條件（25℃，最適pH，最適底物濃度）下，每分鐘轉(zhuǎn)化1

mol底物的酶量。單位為IU/L。目前臨床測(cè)定時(shí)為接近人體環(huán)境，反應(yīng)溫度常選擇37℃，故將IU簡(jiǎn)寫(xiě)為U。催量（Katal單位）：1Katal指在規(guī)定條件下，每秒鐘轉(zhuǎn)化1mol底物的酶量，1U＝1μmol/min＝1×10-6/60s＝16.67nkatal第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)(三)酶活性濃度及其計(jì)算

明確測(cè)定方法的酶單位定義，按照酶單位定義確定物質(zhì)量、體積和時(shí)間的單位。步驟：運(yùn)用公式進(jìn)行計(jì)算。第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)計(jì)算公式:產(chǎn)物的增加量每單位規(guī)定的保溫時(shí)間1000（ml）酶單位/升=—————————×——————————×————————

每單位規(guī)定的產(chǎn)物增加量實(shí)際保溫時(shí)間實(shí)際標(biāo)本用量（ml）

分光光度法測(cè)定的計(jì)算公式

（A測(cè)定–A對(duì)照）·V總·106

每單位規(guī)定的保溫時(shí)間酶單位/升=—————————×————————

·L·V標(biāo)實(shí)際保溫時(shí)間第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)舉例：血清淀粉酶測(cè)定（碘-淀粉比色法）中：若淀粉緩沖液（0.4g/L），用量1.0ml，血清0.02ml。（單位定義：100ml血清37℃，作用15mim每水解5mg淀粉為一個(gè)淀粉酶單位）。淀粉酶活性單位計(jì)算方法如下：第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)(四)正常上限升高倍數(shù)概念：指用測(cè)得的酶活性結(jié)果除以參考范圍上限。即ULN＝例：如某人血ALT測(cè)定結(jié)果為80u/L，該測(cè)定方法正常參考范圍上限為40mmol/L，其ULN＝80/40＝2第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)二、酶活性單位的校準(zhǔn)酶活性測(cè)定的校準(zhǔn)常用兩種方式：一是用實(shí)際測(cè)定的摩爾吸光系數(shù)ε進(jìn)行校準(zhǔn)，二是用酶校準(zhǔn)物進(jìn)行校準(zhǔn)。（一）用實(shí)測(cè)ε校準(zhǔn)使用已知濃度的指示物標(biāo)準(zhǔn)品(如NADH、4-NP、4-NA等)或底物(如葡萄糖)等作為樣本進(jìn)行酶活性測(cè)定，根據(jù)測(cè)出的吸光度值計(jì)算出真實(shí)摩爾吸光系數(shù)ε，然后根據(jù)實(shí)測(cè)ε得出實(shí)測(cè)K值。第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)（二）用酶校準(zhǔn)物校準(zhǔn)利用穩(wěn)定的、定值準(zhǔn)確的酶校準(zhǔn)物或酶參考物進(jìn)行校準(zhǔn)后得到K值。第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)三、酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

研究影響酶促反應(yīng)的因素。影響反應(yīng)速度的因素底物濃度酶濃度溫度PH值激活劑抑制劑第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)（一）

中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)和米－曼氏方程E代表酶，S代表底物，ES代表中間產(chǎn)物，P代表產(chǎn)物1.中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)：第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)2.米-曼氏方程1913年Michaelis和Menten對(duì)中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)進(jìn)行數(shù)學(xué)推導(dǎo)，用簡(jiǎn)單的快速平衡或準(zhǔn)平衡概念推導(dǎo)出了單底物的酶促反應(yīng)方程式即著名的米－曼氏方程式中Vmax為最大反應(yīng)速度，Km為米氏常數(shù)，[S]為底物濃度，V是底物S在不同濃度時(shí)的反應(yīng)速度。Km是酶的特征性常數(shù)之一，只與酶的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)，具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)（二）Km和Vmax的應(yīng)用Km和Vmax的應(yīng)用第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)四、酶促反應(yīng)進(jìn)程(一)酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)

t1t2時(shí)間t圖5-1酶促反應(yīng)進(jìn)程曲線(xiàn)吸光度A延滯期線(xiàn)性期非線(xiàn)性期第一節(jié)酶學(xué)分析技術(shù)基本知識(shí)（二）酶促反應(yīng)進(jìn)程說(shuō)明：1、延滯期：底物與酶結(jié)合啟動(dòng)反應(yīng)階段，持續(xù)時(shí)間1－3min2、線(xiàn)性期（零級(jí)反應(yīng)期）：最大反應(yīng)速度期，是測(cè)定酶活性最佳時(shí)期，持續(xù)時(shí)間1－5min。此期反應(yīng)速度與底物濃度無(wú)關(guān)，而與酶活性成正比。3、非線(xiàn)性期（一級(jí)反應(yīng)期）：底物消耗，反應(yīng)速度不與酶活性成正比，而與底物濃度成正比。第二節(jié)酶活性測(cè)定方法按反應(yīng)時(shí)間分類(lèi)定時(shí)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法第二節(jié)酶活性測(cè)定方法一、定時(shí)法（終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法）

概念：

測(cè)定酶促反應(yīng)開(kāi)始后一段時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量，計(jì)算酶促反應(yīng)的平均速度。第二節(jié)酶活性測(cè)定方法

特點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)單，不需要特種儀器。缺點(diǎn)：難以確定酶促反應(yīng)是否處于線(xiàn)性期。

吸光度

圖1定時(shí)法三種不同反應(yīng)進(jìn)程注意：固定時(shí)間法時(shí)間段的預(yù)定不宜太長(zhǎng)，一般以30～60分鐘為宜。第二節(jié)酶活性測(cè)定方法二、連續(xù)監(jiān)測(cè)法概念：測(cè)定底物或產(chǎn)物隨時(shí)間的變化量，又稱(chēng)為速率法

（連續(xù)監(jiān)測(cè)法是臨床實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定酶活性濃度的最主要的方法。）第二節(jié)酶活性測(cè)定方法2．限定性底物法

以對(duì)－硝基苯麥芽庚糖苷（4NP-G7）為底物，經(jīng)α-淀粉酶催化，水解為游離的寡糖(G5，G4，G3)及葡萄糖殘基減少的對(duì)-硝基苯寡糖苷（4NP-G2，4NP-G3，4NP-G4）。4NP-G2、4NP-G3及部分4NP-G4，在α-葡萄糖苷酶催化下，進(jìn)一步水解為葡萄糖和對(duì)-硝基酚（其摩爾數(shù)僅為酶解底物-4NP-G7的1/3，其余2/3還結(jié)合在4NP-G4中）。對(duì)-硝基酚的生成量在一定范圍內(nèi)與α-淀粉酶活性成正比實(shí)驗(yàn)原理第二節(jié)酶活性測(cè)定方法原理（continuouemonitosing）每隔一定時(shí)間（10～60s）連續(xù)測(cè)定酶反應(yīng)中產(chǎn)物或底物的變化量稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法。又稱(chēng)動(dòng)力法或速率法，終點(diǎn)法的測(cè)定兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，該法進(jìn)行多點(diǎn)連續(xù)測(cè)定。（連續(xù)監(jiān)測(cè)法是臨床實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定酶活性濃度的最主要的方法。）第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)分光光度法單酶反應(yīng)技術(shù)酶偶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)

在代謝物酶學(xué)分析技術(shù)中，分光光度法是最常用的測(cè)定手段。根據(jù)測(cè)定方法的原理不同，一般將其分為單酶反應(yīng)和酶偶聯(lián)反應(yīng)兩種技術(shù)。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)

單酶反應(yīng)比較簡(jiǎn)單，一般將工具酶和待測(cè)物一起保溫，可按照定時(shí)法或連續(xù)監(jiān)測(cè)法對(duì)待測(cè)產(chǎn)物或底物進(jìn)行測(cè)定，在相對(duì)應(yīng)的氧化還原酶作用下產(chǎn)生可以直接檢測(cè)的信號(hào)。一、單酶反應(yīng)技術(shù)第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)二、酶偶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)

酶偶聯(lián)反應(yīng)是在反應(yīng)體系中加入一個(gè)或幾個(gè)工具酶，將待測(cè)酶生成的某一產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為可直接測(cè)定的產(chǎn)物，當(dāng)加入酶的反應(yīng)速度與待測(cè)酶反應(yīng)速度達(dá)到平衡時(shí)，可以用工具酶的反應(yīng)速度來(lái)代表待測(cè)酶的活性。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)（一）工具酶概念：

通常把酶學(xué)分析技術(shù)中作為試劑用于測(cè)定代謝物濃度或酶活性的酶稱(chēng)為工具酶（toolenzyme）。常用的工具酶多為氧化還原酶類(lèi)，這是因?yàn)檠趸€原酶的產(chǎn)物最容易被直接監(jiān)測(cè)。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)常用工具酶的名稱(chēng)及其縮寫(xiě)符號(hào)名稱(chēng)縮寫(xiě)輔酶名稱(chēng)縮寫(xiě)符號(hào)乳酸脫氫酶LDHNAD＋己糖激酶HK蘋(píng)果酸脫氫酶MDHNAD＋肌酸激酶CK6-磷酸葡萄糖脫氫酶G6PDNADP＋丙酮酸激酶PK谷氨酸脫氫酶GLDH

甘油激酶GK葡萄糖氧化酶GOD

脂蛋白脂肪酶LPL膽固醇氧化酶COD

膽固醇酯酶CE磷酸甘油氧化酶GPD

脲酶Ure過(guò)氧化物酶POD

肌酐酶Cr第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)

例如葡萄糖的測(cè)定中，在己糖激酶（HK）催化下，葡萄糖和ATP發(fā)生磷酸化反應(yīng)，生成葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)與ADP。前者在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G-6-PD)催化下脫氫，生成6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)使NADP還原成NADPH，然后檢測(cè)340nm吸光度的改變，間接測(cè)得葡萄糖濃度。在這里，血清葡萄糖為待測(cè)物，HK、G-6-PD為工具酶，其作用相當(dāng)于試劑。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)（一）酶偶聯(lián)反應(yīng)酶偶聯(lián)反應(yīng)最簡(jiǎn)單的模式為：Ex為待測(cè)酶，A為底物，B為中間產(chǎn)物。A、B二物質(zhì)的變化無(wú)法直接監(jiān)測(cè)，此時(shí)可外加第二個(gè)酶Ei(為指示酶)，其底物為B，反應(yīng)產(chǎn)物為P可直接測(cè)定。物為P可直接測(cè)定。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)1.酶偶聯(lián)反應(yīng)原理:

預(yù)孵育期先將Ei加入樣本中保溫，使內(nèi)源性A和B消耗殆盡延滯期然后加入底物啟動(dòng)反應(yīng)，開(kāi)始反應(yīng)速度較慢線(xiàn)性反應(yīng)期隨著反應(yīng)的進(jìn)行B的生成速度等于轉(zhuǎn)化為P的速度，反應(yīng)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡非恒態(tài)期反應(yīng)后期，底物已經(jīng)大部分消耗，反應(yīng)速度減慢第二節(jié)胰腺疾病的實(shí)驗(yàn)室檢查酶偶聯(lián)法測(cè)定ALT的吸光度變化圖

在應(yīng)用酶偶聯(lián)法測(cè)定時(shí)，關(guān)鍵在于確定恒態(tài)期，因?yàn)橹挥泻銘B(tài)期才能代表酶活性。如酶促反應(yīng)底物動(dòng)力學(xué)所述，恒態(tài)期可以通過(guò)測(cè)定指示酶的Km和Vmax等動(dòng)力學(xué)因數(shù)加以計(jì)算確定。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)2.常用指示酶及其指示反應(yīng)（1）偶聯(lián)NAD(P)+或NAD(P)H的脫氫酶指示系統(tǒng)（紫外吸收法）

用作工具酶的脫氫酶都是以NAD(P)H為輔酶的脫氫酶，例如LDH、MDH、G-6-PD、GLDH等，它們催化下列反應(yīng)：

P+NAD(P)H+H+

PH2+NAD(P)+可對(duì)NAD(P)H在紫外吸收或紫外激發(fā)熒光進(jìn)行測(cè)定

應(yīng)用：ALT、AST、CK等酶活性測(cè)定。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)優(yōu)點(diǎn):應(yīng)用廣泛缺點(diǎn)：①要用紫外分光光度計(jì)，因?yàn)橐O(jiān)測(cè)340nm吸光度變化，這限制了它的應(yīng)用；

②要求使用高純度的酶和輔酶，增加費(fèi)用；

③靈敏度低。這是因?yàn)镹AD(P)H的摩爾消光系數(shù)只有6.22×103。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)（2）偶聯(lián)H2O2的過(guò)氧化物酶指示系統(tǒng)（色原顯色法）

POD可催化過(guò)氧化氫與某些色原反應(yīng)，例如與4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反應(yīng)，將其氧化為有色物質(zhì)，反應(yīng)如下：Trinder反應(yīng)：

POD2H2O2+4-AAP+酚醌亞胺（紅色）+4H2O色原物質(zhì)應(yīng)用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（屬于氧化酶類(lèi)）等都可以將各自的底物氧化為過(guò)氧化氫，因此都可以與POD偶聯(lián)，通過(guò)Trinder反應(yīng)加以測(cè)定。第三節(jié)代謝物酶學(xué)分析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)：①在可見(jiàn)光范圍測(cè)定，便于推廣應(yīng)用；②對(duì)酶的純度要求不高，故生產(chǎn)方便，價(jià)格低廉；③靈敏度高于脫氫酶系統(tǒng)。缺點(diǎn)：容易受維生素C、尿酸、膽紅素和谷胱甘肽等還原性物質(zhì)的干擾，嚴(yán)重時(shí)測(cè)定結(jié)果會(huì)出現(xiàn)假性負(fù)值。目前一般采用雙試劑劑型，在試劑1中加入抗壞血酸氧化酶、亞鐵氰化鉀等來(lái)消除維生素C、膽紅素等的干擾。第四節(jié)同工酶分析概念：同工酶(isozyme)是指同一種屬中由不同基因或等位基因所編碼的多肽鏈單體、純聚體或雜化體，具有相同的催化功能，但其分子組成、空間構(gòu)象、理化性質(zhì)、生物學(xué)性質(zhì)以及器官分布和細(xì)胞定位不同的一類(lèi)酶。由于同工酶在體內(nèi)呈現(xiàn)組織器官或細(xì)胞內(nèi)區(qū)域化分布，具有組織特異性，因而同工酶的測(cè)定具有很大的臨床診斷價(jià)值。第四節(jié)同工酶分析一、同工酶產(chǎn)生的機(jī)制根據(jù)產(chǎn)生酶分子不同結(jié)構(gòu)形式的原因，可將同工酶分為：(一)基因性同工酶基因性同工酶(geneticisozyme)或原級(jí)同工酶(primaryisozyme)是由不同基因所編碼的多肽鏈所組成的酶蛋白。(二)次生同工酶次生同工酶或轉(zhuǎn)譯后同工酶是由同一基因、同一信使RNA轉(zhuǎn)錄生成原始的酶蛋白，再經(jīng)過(guò)不同的化學(xué)修飾，如磷酸化、肽鏈斷裂、糖鏈上的糖基增減等形成不同結(jié)構(gòu)的酶蛋白，它們的免疫性往往相同。第四節(jié)同工酶分析二、同工酶的測(cè)定方法

同工酶氨基酸組成不同，等電點(diǎn)不同，電泳遷移率也就不同，據(jù)此可用電泳法分離鑒定。（常規(guī)實(shí)驗(yàn)室同工酶常用的測(cè)定方法。）

（一）電泳法

第四節(jié)同工酶分析（二）色譜法(層析法)根據(jù)同工酶分子荷電量不同，可用離子交換層析法加以分離。（用于同工酶的提純和制備，方法費(fèi)時(shí)繁瑣不適用于臨床同工酶的常規(guī)檢測(cè)。）第四節(jié)同工酶分析

由于同工酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)不同，因而免疫學(xué)性質(zhì)也不相同?？蓪⑼っ阜蛛x純化后制備抗血清，用于同工酶的分離鑒定。常用的方法有免疫抑制法、免疫沉淀法和免疫化學(xué)法。（三）

免疫法第四節(jié)同工酶分析（四）

光譜法

光譜法是控制酶促反應(yīng)條件，用光譜光度分析進(jìn)行酶活性測(cè)定的方法。光譜法選擇性抑制法底物特異性分析法最適pH控制法熱失活法利用一些化學(xué)抑制劑對(duì)同工酶的選擇性抑制的特性，對(duì)同工酶進(jìn)行測(cè)定的方法。利用同工酶對(duì)底物的Km及親和力的差別，對(duì)同工酶進(jìn)行鑒定的方法。利用各型同工酶對(duì)熱的穩(wěn)定性差異的分析方法。利用同工酶的最適pH的差異進(jìn)行分析的方法。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素

滿(mǎn)足酶促反應(yīng)速率達(dá)到最大反應(yīng)速率所需的條件。主要包括：①合適的底物及底物濃度；②理想的緩沖液及最適離子強(qiáng)度；③最適溫度；④最適pH值；⑤合適的輔因子、激活劑濃度；⑥酶偶聯(lián)反應(yīng)中合適的指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度；⑦合理的測(cè)定時(shí)間；⑧合適的樣本與反應(yīng)試劑的比例；⑨足夠的檢測(cè)范圍；⑩盡量除去各種抑制劑等。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素

某些情況下，為使最終測(cè)定系統(tǒng)達(dá)到最大的測(cè)定重復(fù)性，可考慮對(duì)最適條件進(jìn)行適當(dāng)修改一、樣本采集和處理1．樣本采集溶血標(biāo)本不能用于血清酶的測(cè)定。2．處理靜脈采血后的1h～2h內(nèi)應(yīng)及時(shí)離心分離出血清(漿)，并及時(shí)測(cè)定，避免血細(xì)胞因膜能量不足通透性增加導(dǎo)致血細(xì)胞內(nèi)酶釋放入血或因其他因素影響造成誤差。

第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素3．保存不同貯存溫度時(shí)體液酶的穩(wěn)定性(活性變化小于10%)酶室溫(25°C)

冷藏(0～4°C)冰凍(-25°C)LD1周1d～3d§1d～3d§γ-GT2d1周1月ALD2d2d不穩(wěn)定★ALT2d5d不穩(wěn)定★AST3d1周1月CK1周1周1月ChE1周1周1周ALP2d～3d2d～3d1月ACP4h※3d＃3d＃5′-NT24h1周3月AMY1月7月2月LPS1周3周3周LAP1周1周1周注：★酶不耐融化；§與同工酶類(lèi)型有關(guān)；※標(biāo)本未酸化；＃標(biāo)本加檸檬酸或醋酸至pH5.0第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素4．樣本與試劑的體積比應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格控制樣本與試劑的體積比，一旦確定，就不能隨意改變。一般推薦樣本與試劑的體積比為1∶10。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素二、試劑因素1．底物的種類(lèi)對(duì)于專(zhuān)一性不強(qiáng)的酶，在選擇選擇底物時(shí)應(yīng)注意以下幾項(xiàng)原則：①一般選擇Km最小的底物；②底物應(yīng)有足夠的溶解度；③酶對(duì)底物的特異性高；④底物的穩(wěn)定性好。2．底物的濃度對(duì)于單一底物的酶促反應(yīng)一般酶測(cè)定時(shí)底物濃度最好為Km值的10～20倍；而雙底物反應(yīng)的可能機(jī)制有乒乓機(jī)制(如ALT、AST)、有序反應(yīng)(如LDH、GLDH)、隨機(jī)反應(yīng)(如CK)三種。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素3．緩沖液的種類(lèi)、pH和離子強(qiáng)度理想的緩沖液應(yīng)具備以下條件：①有足夠的緩沖容量；②純度高，不含有抑制酶活性的雜質(zhì)；③受溫度影響小，即pH不易受溫度的變化而變化；④對(duì)酶活性表達(dá)有促進(jìn)作用則更好；⑤對(duì)酶有穩(wěn)定作用。常用緩沖液分為活性緩沖液、惰性緩沖液和抑制性緩沖液三大類(lèi)。4．輔因子結(jié)合酶離開(kāi)它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性，因此在酶活性測(cè)定時(shí)，要保證輔基或輔酶的供給。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素5．激活劑能提高酶活性的物質(zhì)都稱(chēng)為酶的激活劑，其中大部分是無(wú)機(jī)離子或簡(jiǎn)單的有機(jī)化合物。6．抑制劑凡是能降低酶的活性但又不引起酶分子變性失活的物質(zhì)統(tǒng)稱(chēng)為酶的抑制劑。在設(shè)計(jì)和選擇酶的測(cè)定方法時(shí)，應(yīng)設(shè)法避免其對(duì)酶促作用的影響。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素三、方法學(xué)因素1．方法等級(jí)的選擇在條件許可的情況下，測(cè)定酶活性時(shí)盡可能采用速率法，少用或不用定時(shí)法。2．檢測(cè)底物或產(chǎn)物的選擇產(chǎn)物是從無(wú)到有，反應(yīng)顯色明顯，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度較高。因此，原則上應(yīng)選擇測(cè)定產(chǎn)物的生成量而不是底物的消耗量。第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素3．啟動(dòng)模式的選擇底物啟動(dòng)模式(IFCC推薦采用)：指樣本先與缺乏某種底物的試劑1預(yù)孵育一定時(shí)間后，再加入含這種底物的試劑2，開(kāi)始啟動(dòng)樣本中的待測(cè)酶的酶促反應(yīng)。4．正向反應(yīng)與逆向反應(yīng)的選擇正向反應(yīng)是測(cè)定產(chǎn)物的生成量即測(cè)定吸光度的增加值，在生化分析儀上描述為正向/向上/(＋)；逆向反應(yīng)是測(cè)定底物的消耗量，描述為負(fù)向/向下/(－)。四、儀器因素第五節(jié)酶活性測(cè)定的影響因素1．反應(yīng)溫度由于酶反應(yīng)受溫度影響很大，在測(cè)定時(shí)間內(nèi)，反應(yīng)體系的溫度變化應(yīng)控制在37C±0.1C內(nèi)。2．反應(yīng)時(shí)間

酶活性測(cè)定相關(guān)的時(shí)間是延滯時(shí)間和線(xiàn)性期監(jiān)測(cè)時(shí)間。延滯期的確定可通過(guò)多觀察濃度不等、病理情況不同的樣本，選擇延滯期最長(zhǎng)者作為確定值，選擇線(xiàn)性期最短的為監(jiān)測(cè)時(shí)間的確定值。線(xiàn)性期時(shí)間的確定主要是通過(guò)讀數(shù)次數(shù)和讀數(shù)間隔來(lái)決定。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用

小明最近厭油，食欲精神不振，去看醫(yī)生，醫(yī)生了解具體情況后給小明開(kāi)了肝功能檢查，發(fā)現(xiàn)ALT和AST都有升高，醫(yī)生結(jié)合具體情況最后診斷為：急性甲型肝炎

接下來(lái)讓我們一起去學(xué)習(xí)下看看醫(yī)生為什么會(huì)下這個(gè)診斷吧第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用

酶是組織細(xì)胞合成的，通過(guò)細(xì)胞的分泌和胞吐作用進(jìn)入血液、腦脊液、尿液及羊水等體液中。臨床上可根據(jù)不同體液中酶濃度的變化來(lái)診斷各種疾病。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用酶濃度的變化由細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性變化引起細(xì)胞內(nèi)酶合成增加所致酶排泄障礙引起臟器或組織損傷提示組織再生、修復(fù)、異位分泌或提示惡性腫瘤的可能有梗阻存在通常開(kāi)展測(cè)定的是血清酶或血漿酶。要全面了解影響各種血清(漿)酶變化的因素，首先要了解血清(漿)酶的分類(lèi)及變化機(jī)制。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用一、血液酶的來(lái)源血液中的酶根據(jù)來(lái)源及作用不同，可分為:血漿特異酶非血漿特異酶大多數(shù)在肝臟合成，當(dāng)肝實(shí)質(zhì)性病變時(shí)，該類(lèi)酶在血中的濃度明顯下降外分泌酶:源于消化腺或其他外分泌腺,其在血液中的含量與相應(yīng)的外分泌腺的功能與疾病有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)酶：存在于組織細(xì)胞中，組織細(xì)胞病變、細(xì)胞膜通透性增加或細(xì)胞壞死等病理狀態(tài)下，細(xì)胞內(nèi)酶可大量進(jìn)入血液，導(dǎo)致血漿酶活性顯著增高。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用二、血液中酶濃度的變化機(jī)制血液中酶濃度的變化原因由細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性變化引起細(xì)胞內(nèi)酶合成增加所致酶排泄障礙引起由細(xì)胞壞死或細(xì)胞膜通透性變化引起酶合成障礙、中毒或遺傳缺陷酶進(jìn)入血液途徑和清除方法的差異性第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用（一）酶合成異常

1．合成減少

原因：肝臟損害時(shí)由于酶的合成能力受損，血液中相應(yīng)的酶減少，慢性肝病時(shí)更為明顯。由于酶基因變異也可引起酶合成減少。

應(yīng)用：肝豆?fàn)詈俗冃?Wilson病)患者，血液中銅氧化酶可明顯下降。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用2．合成增多

原因：細(xì)胞對(duì)酶的合成增加或酶的誘導(dǎo)合成作用是血液中酶升高的重要原因。

應(yīng)用：增生性疾病如骨骼疾病時(shí)，可因成骨細(xì)胞增生合成和分泌更多的ALP使血液中此酶增高。部分腫瘤患者血液中酶升高可能與腫瘤細(xì)胞中酶的合成增多有關(guān)。此外酶的誘導(dǎo)合成作用也可引起血液中一些酶的濃度增加。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用（二）酶釋放增加

1．細(xì)胞內(nèi)外酶濃度的差異

由于非血漿特異酶在細(xì)胞內(nèi)外的濃度差異大，從而對(duì)血清酶濃度增加速率影響大，只要有少量細(xì)胞受損，酶從細(xì)胞中釋出，就可使血液中酶濃度明顯升高。

當(dāng)細(xì)胞損傷或病變時(shí)，大量細(xì)胞內(nèi)酶釋放入血是引起血清酶增高的主要機(jī)制。第六節(jié)診斷酶學(xué)在臨床的應(yīng)用

例如病毒性肝炎時(shí)ALT活性增高。（