2025版高考生物二輪復習課件 易錯點12 雙標記基因載體

雙標記基因載體易

錯點12[名師支招]1.雙標記基因載體的作用

雙標記基因載體具有兩個標記性狀，如四環(huán)素抗性和青霉素抗性，在基因表達載體的構建中會破壞其中一個，如破壞四環(huán)素抗性，含有目的基因的基因表達載體此時只有青霉素抗性，而空載體依然具有四環(huán)素抗性和青霉素抗性，通過在培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，可以區(qū)分出含有目的基因的載體和空載體。2.雙標記原理 (1)單標記的區(qū)分問題：僅有一個標記基因時，含有目的基因的載體和空載體都有標記，在篩選時無法區(qū)分。(2)雙標記方法：將目的基因插入含有兩種抗生素抗性基因的載體時，如果目的基因插入某種抗生素抗性基因內(nèi)部，則會導致該抗生素抗性基因失活。如圖所示，目的基因插入了四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，則四環(huán)素抗性基因失活。篩選方法：將細菌先放在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，能生長的是含重組載體的細菌和含空載體的細菌，如圖中1、2、3、4、5菌落，再利用滅菌的絨布將上述5個菌落影印到含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上，如上圖，能生長的菌落為2、3、4，則在含四環(huán)素培養(yǎng)基上不生長的即為含有目的基因的菌落，如圖中1、5菌落。最后，可在含氨芐青霉素的培養(yǎng)基上挑取1、5菌落進行培養(yǎng)。提醒①標記基因本身也是一個能正常表達的基因，具有自己的啟動子和終止子。②受體細胞不同，標記基因種類也不同；受體細胞為細菌時，標記基因通常是抗生素抗性基因；受體細胞為真核細胞，尤其是動植物細胞時，抗生素很多時候不能殺死未標記的細胞，無法起到篩選的效果，此時標記基因通常選擇熒光基因等。[典例賞析]1.(2024·山東青島期末)研究人員將大麥細胞的LTP1基因?qū)虢湍钢校尳湍府a(chǎn)生LTP1蛋白。下圖為該實驗過程的部分流程。下列說法正確的是(

)BA.運用PCR擴增LTP1基因時，應選擇圖1的A和D作為引物B.為方便構建重組質(zhì)粒，可在引物5′端添加限制酶的識別序列C.篩選導入重組質(zhì)粒的啤酒酵母時，只需配制含青霉素的培養(yǎng)基D.為了讓大麥的基因在酵母中表達，需要在目的基因兩側添加大麥的啟動子和終止子解析

DNA復制子鏈延伸的方向只能從5′端到3′端，也就是DNA聚合酶只能從引物的3′端延伸DNA鏈，由圖可知，構建前利用PCR技術擴增目的基因時，應選取B和C作為引物，A錯誤；為構建目的基因和質(zhì)粒連接的重組質(zhì)粒，往往需要在引物5′端適當增加限制酶識別序列方便切割，B正確；由圖可知，構建基因表達載體時，四環(huán)素抗性基因被破壞，而青霉素抗性基因沒有被破壞，因此將導入C的酵母菌分別在含有青霉素和四環(huán)素的兩種選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)，則在含有青霉素的培養(yǎng)基上能存活，但在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上不能存活的才是導入重組質(zhì)粒的啤酒酵母，C錯誤；為了讓大麥的基因在酵母中表達，需要在目的基因上游添加酵母的啟動子，下游添加酵母的終止子，D錯誤。2.(2024·江蘇海安高級中學聯(lián)考)熒光蛋白(GFP)在紫外光下會發(fā)出綠色熒光，某科研團隊將GFP基因插入質(zhì)粒P中構建了重組質(zhì)粒載體P0，用于基因工程中基因表達載體(P1)的篩選和鑒定。部分過程如圖所示，如表為部分限制酶的識別序列及切割位點?；卮鹣铝袉栴}：(1)過程①中用EcoRⅤ酶切獲得的目的基因具有________末端，過程②表示利用PCR技術擴增目的基因，前提是要根據(jù)________________________設計出引物。(2)過程③中，質(zhì)粒P0需用限制酶________切割，與擴增出的目的基因在__________酶作用下形成P1。平目的基因的一段核苷酸序列BamHⅠDNA連接(3)為了篩選出含有質(zhì)粒P1的菌落，需采用添加________的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在紫外光下____________________的菌落，為含有P1的菌落。(4)提取經(jīng)上述篩選所得菌落的RNA，通過________獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出目的基因，可能的原因是___________________________。進行擴增時需先加熱至90～95℃，加入引物后冷卻至55～60℃，以上調(diào)控溫度操作的目的分別是__________________、________________________。四環(huán)素不發(fā)出綠色熒光逆轉(zhuǎn)錄目的基因未能在受體菌中轉(zhuǎn)錄使DNA解聚為單鏈使引物與互補DNA鏈結合解析

(1)由表格可知，用EcoRⅤ酶切獲得的目的基因具有平末端。過程②表示利用PCR技術擴增目的基因，需要根據(jù)目的基因的一段核苷酸序列設計出引物。(2)由圖可知，構建P1時，限制酶Sau3AⅠ會破壞四環(huán)素抗性基因(標記基因)，而EcoRⅤ會破壞復制原點，可選擇BamHⅠ切割，與擴增出的目的基因在DNA連接酶作用下形成P1。(3)為了篩選含有質(zhì)粒P1的菌落，由于標記基因是四環(huán)素抗性基因，所以需采用添加了四環(huán)素的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在紫外光下，由于BamHⅠ破壞了GFP基因，所以選擇不發(fā)出綠色熒光的菌落，為含有P1的菌落。(4)所得菌落的RNA通過逆轉(zhuǎn)錄獲得DNA，再進行PCR擴增，若最終未能檢測出目的基因，可能的原因是目的基因未能在受體菌中轉(zhuǎn)錄。當溫度上升到90℃以上時，雙鏈DNA解聚為單鏈，溫度下降到50