2025版高考生物二輪復習 課時2 賦予生物新的遺傳特性的基因工程

課時2賦予生物新的遺傳特性的基因工程重點1基因工程和蛋白質(zhì)工程【知識盤查】1.歸納基因工程的基本工具提醒若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，則能使目的基因和載體定向連接，避免自身環(huán)化和反向連接，提高連接的有效性。2.理解掌握基因工程的操作步驟(1)目的基因的篩選與獲取(2)基因表達載體的構(gòu)建——重組質(zhì)粒的構(gòu)建提醒①啟動子和終止子：啟動子(DNA片段)≠起始密碼子(位于mRNA上)；終止子(DNA片段)≠終止密碼子(位于mRNA)上。②目的基因插入位置：啟動子與終止子之間。③利用乳腺生物反應器生產(chǎn)藥物時，應將目的基因與乳腺中特異表達的基因的啟動子等調(diào)控元件重組在一起。(3)將目的基因?qū)胧荏w細胞(4)目的基因的檢測與鑒定提醒PCR技術(shù)不僅可用于獲取和擴增目的基因，還能用于檢測受體細胞中是否含有目的基因或受體細胞中的目的基因是否轉(zhuǎn)錄出mRNA。3.圖示法解讀蛋白質(zhì)工程【曾經(jīng)這樣考】1.(2023·新課標卷，6)某同學擬用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA連接酶為工具，將目的基因(兩端含相應限制酶的識別序列和切割位點)和質(zhì)粒進行切割、連接，以構(gòu)建重組表達載體。限制酶的切割位點如圖所示。下列重組表達載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是()A.質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B.質(zhì)粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C.質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D.質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接答案C解析酶3切割后得到的是平末端，應該用T4DNA連接酶連接，A不符合題意；質(zhì)粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能連接，B不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4DNA連接酶連接，還能保證目的基因在質(zhì)粒上的連接方向，此重組表達載體的構(gòu)建方案最合理且高效，C符合題意；若用酶2和酶4切割質(zhì)粒和目的基因，會破壞質(zhì)粒上的抗生素抗性基因，連接形成的基因表達載體缺少標記基因，無法進行后續(xù)的篩選，D不符合題意。2.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在醫(yī)藥等領(lǐng)域有重要的應用價值。利用L－谷氨酸脫羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脫羧是高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的重要途徑之一。研究人員采用如下圖方法將釀酒酵母S的L－谷氨酸脫羧酶基因(gadB)導入生產(chǎn)菌株E.coliA，構(gòu)建了以L－谷氨酸鈉為底物高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列敘述正確的是()A.圖中表明，可以從釀酒酵母S中分離得到目的基因gadBB.E.coliB發(fā)酵生產(chǎn)γ－氨基丁酸時，L－谷氨酸鈉的作用是供能C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ構(gòu)建重組質(zhì)粒答案A解析分析題意，可以從釀酒酵母S中篩選、分離出目的基因gadB，然后利用PCR擴增目的基因，A正確；由題意知，L－谷氨酸鈉是生產(chǎn)γ－氨基丁酸的底物，不能用來供能，B錯誤；將目的基因(gadB)導入菌株E.coliA構(gòu)建高效生產(chǎn)γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C錯誤；根據(jù)題干提供的信息，無法推斷出是否有其他酶能夠替代NcoⅠ和KpnⅠ，D錯誤。3.(2023·重慶卷，12)某小組通過PCR(假設引物長度為8個堿基，短于實際長度)獲得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶進行酶切(如下圖)，再用所得片段成功構(gòu)建了基因表達載體。下列敘述錯誤的是()A.實驗所用引物，其中一個序列為5′－TGCGCAGT－3′B.步驟①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠC.用步驟①的酶對載體進行酶切至少獲得了2個片段D.酶切片段和載體連接時可使用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶答案B解析根據(jù)擴增所得DNA片段可知，實驗所用的兩種引物序列為5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正確；根據(jù)酶切后得到的黏性末端判斷，步驟①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B錯誤；步驟①用兩種酶切割載體(質(zhì)粒)，質(zhì)粒上至少有兩個切口，至少產(chǎn)生2個片段，C正確；目的基因片段和質(zhì)粒經(jīng)酶切后產(chǎn)生的均為黏性末端，可用E.coliDNA連接酶或T4DNA連接酶連接，D正確。4.(2024·新課標卷，35)某研究小組將纖維素酶基因(N)插入某種細菌(B1)的基因組中，構(gòu)建高效降解纖維素的菌株(B2)。該小組在含有N基因的質(zhì)粒中插入B1基因組的M1與M2片段；再經(jīng)限制酶切割獲得含N基因的片段甲，片段甲兩端分別為M1與M2；利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)將片段甲插入B1的基因組，得到菌株B2。酶切位點(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的結(jié)合位置、片段甲替換區(qū)如下圖所示，→表示引物5′→3′方向?；卮鹣铝袉栴}。(1)限制酶切割的化學鍵是________。為保證N基因能在菌株B2中表達，在構(gòu)建片段甲時，應將M1與M2片段分別插入質(zhì)粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位點之間，原因是________________________________________________________________________________________________________________________________。(2)CRISPR/Cas9技術(shù)可以切割細菌B1基因組中與向?qū)NA結(jié)合的DNA。向?qū)NA與B1基因組DNA互補配對可以形成的堿基對有G—C和____________________。(3)用引物P1和P2進行PCR可驗證片段甲插入了細菌B1基因組，所用的模板是____________；若用該模板與引物P3和P4進行PCR，實驗結(jié)果是___________________________________________________________________。(4)與秸稈焚燒相比，利用高效降解纖維素的細菌處理秸稈的優(yōu)點是_____________________________________________________________________________________________________________________(答出2點即可)。答案(1)磷酸二酯鍵保證N基因啟動子、N基因、N基因終止子的完整性，確保N基因能夠順利表達(2)C—G、U—A、A—T(3)菌株B2的基因組無PCR產(chǎn)物(4)無空氣污染；更安全，無火災隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等解析(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯鍵。由題述可知，該過程是將重組質(zhì)粒特定位點，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替換區(qū)(M1＋啟動子＋N基因＋終止子＋M2)，再接入B1基因組中，得到B2，因此在M1和M2之間，需要保證N基因完整性，同時需要保證N基因能夠正常表達，因此需要把M1接入啟動子之前，M2接入終止子之后。(2)根據(jù)所給信息，向?qū)NA需要與對應DNA進行結(jié)合，結(jié)合期間，RNA的堿基會和DNA的堿基進行互補配對，根據(jù)堿基互補配對原則配對方式包括G—C、C—G、U—A、A—T。(3)需要驗證是否插入重組后的片段甲，因此所用模板為菌株B2的基因組，如果有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中含有N基因，如果沒有PCR產(chǎn)物說明菌株B2中不含N基因。因為片段甲被替換，因此在重組片段甲(M1＋啟動子＋N基因＋終止子＋M2)中，沒有引物P4的結(jié)合位置，因此使用引物P3、P4進行PCR時，無法獲得PCR產(chǎn)物。(4)秸稈焚燒嚴重污染環(huán)境，且有很大的火災隱患，與此同時，焚燒對于有機物中的能量是極大的浪費，可以從上述角度進行論述。例如：無空氣污染；更安全，無火災隱患；分解效率更高，高效利用秸稈資源等。【還會這樣考】1.(2024·九省聯(lián)考甘肅卷，15)胰島素可用于治療糖尿病，我國科學家打破國外技術(shù)壟斷，研發(fā)了擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的重組人胰島素藥物，下列敘述錯誤的是()A.用PCR技術(shù)擴增人胰島素基因時，每次循環(huán)包括變性、復性、延伸三步B.構(gòu)建人胰島素基因表達載體時，需使用限制性內(nèi)切核酸酶和DNA連接酶C.大腸桿菌細胞經(jīng)Ca2＋處理后，更容易吸收重組的人胰島素基因表達載體D.抗原－抗體雜交法不能檢測人胰島素基因表達載體是否導入大腸桿菌細胞答案D解析用PCR技術(shù)擴增人胰島素基因時，擴增的過程是：目的基因DNA受熱變性后解為單鏈，引物與單鏈相應互補序列結(jié)合；然后以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶作用下進行延伸，即將4種脫氧核苷酸加到引物的3′端，如此重復循環(huán)多次。每次循環(huán)一般可以分為變性、復性和延伸三步，A正確；在構(gòu)建人胰島素基因表達載體時，首先用一定的限制性內(nèi)切核酸酶切割含有目的基因的DNA片段和載體，再利用DNA連接酶將目的基因片段拼接到載體的切口處，這樣就形成了一個重組DNA分子，B正確；大腸桿菌細胞經(jīng)Ca2＋處理后，細胞處于一種能吸收周圍環(huán)境中DNA分子的生理狀態(tài)，更容易吸收重組的人胰島素基因表達載體，C正確；抗原－抗體雜交法可以檢測人胰島素基因是否在大腸桿菌中翻譯成胰島素，若抗原－抗體雜交結(jié)果為陽性，說明人胰島素基因在大腸桿菌中表達，則可以說明人胰島素基因表達載體導入了大腸桿菌細胞中，D錯誤。2.(2024·重慶市質(zhì)量檢測)煙草是我國一些地區(qū)的經(jīng)濟作物之一，提高煙草質(zhì)量有利于提高經(jīng)濟收入。我國科研團隊研究了一種轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種，抗鹽基因的結(jié)構(gòu)和獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種的過程(①～⑤)如圖所示?；卮鹣铝袉栴}：(1)獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中利用的生物技術(shù)有________________________________________________________________________________________________________________________(答出2項)等。(2)為確保目的基因定向插入質(zhì)粒，應該選擇限制酶________________切割含目的基因的DNA和質(zhì)粒。在培養(yǎng)基中加入____________(填“氨芐青霉素”或“四環(huán)素”)以便于重組DNA分子的篩選。(3)培育轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種的核心工作是圖中過程________(填序號)。過程②③采用的方法是________。(4)過程⑤需要用到____________等植物激素，在誘導愈傷組織分化成幼苗的過程中，這兩種植物激素的比例會發(fā)生變化，原因是______________________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)基因工程技術(shù)(或重組DNA技術(shù))、植物組織培養(yǎng)技術(shù)(2)HindⅢ和SalⅠ氨芐青霉素(3)①農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法(4)生長素、細胞分裂素誘導愈傷組織分化成幼苗的過程中，需要誘導生成根、芽等不同組織，而當生長素用量與細胞分裂素用量的比值大時有利于根的分化，當生長素用量與細胞分裂素用量的比值小時有利于芽的分化解析(1)①～③過程中利用了基因工程技術(shù)，煙草細胞→愈傷組織→轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草幼苗的過程中利用了植物組織培養(yǎng)技術(shù)。因此，獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草新品種過程中利用的生物技術(shù)有基因工程技術(shù)、植物組織培養(yǎng)技術(shù)等。(2)抗鹽基因(目的基因)中含有限制酶BamHⅠ的切割位點，若用限制酶BamHⅠ切割含抗鹽基因的DNA，則會破壞抗鹽基因，因此不能用限制酶BamHⅠ切割含抗鹽基因的DNA；抗鹽基因兩端含有限制酶SalⅠ的切割位點，質(zhì)粒上也含有限制酶SalⅠ的切割位點，若用限制酶SalⅠ切割含抗鹽基因的DNA和質(zhì)粒，然后用DNA連接酶連接，則可能會造成質(zhì)粒和抗鹽基因自身環(huán)化，或者使抗鹽基因在質(zhì)粒中反向連接。因此應該用兩種限制酶切割含抗鹽基因的DNA和質(zhì)粒，經(jīng)分析可知，可用限制酶HindⅢ、SalⅠ切割含目的基因(抗鹽基因)的DNA和質(zhì)粒，以確保目的基因定向插入質(zhì)粒。由于用限制酶HindⅢ、SalⅠ切割質(zhì)粒時，破壞了四環(huán)素抗性基因，而氨芐青霉素抗性基因沒有被破壞，因此應在培養(yǎng)基中加入氨芐青霉素，以便于重組DNA分子的篩選。(3)基因工程的核心步驟是基因表達載體的構(gòu)建，即圖中過程①。過程②③采用的方法是農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法。(4)過程⑤是再分化，需要用到生長素、細胞分裂素等植物激素。在誘導愈傷組織分化成幼苗的過程中，這兩種植物激素的比例會發(fā)生變化，這是因為誘導愈傷組織分化成幼苗的過程中，需要誘導生成根、芽等不同組織，而當生長素用量與細胞分裂素用量的比值大時有利于根的分化，當生長素用量與細胞分裂素用量的比值小時有利于芽的分化。3.(2024·湖南雅禮中學調(diào)研)金屬硫蛋白(MT)是一類低分子量、富含半胱氨酸、具有金屬結(jié)合能力的普遍存在于生物體內(nèi)的金屬結(jié)合蛋白，具有多種生物學功能。近年來，因其與Zn、Cu、Cd等金屬的結(jié)合能力較強而用于生態(tài)修復?？蒲腥藛T成功地將人MT蛋白基因用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入番茄，成功培育轉(zhuǎn)基因番茄。回答下列問題：注：T－DNA中標出的啟動子在真核細胞中表達。(1)感受態(tài)農(nóng)桿菌的制備：取保存的農(nóng)桿菌菌落用________接種于相應的液體培養(yǎng)基中，并置于________中進行振蕩培養(yǎng)，完成菌種的活化和擴大培養(yǎng)；取適量菌液置于CaCl2溶液中處理，制得感受態(tài)農(nóng)桿菌。(2)目的基因的獲取和轉(zhuǎn)化：取人肝臟細胞，破碎后提取mRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下形成cDNA，經(jīng)PCR擴增后的產(chǎn)物與Ti質(zhì)粒連接形成重組質(zhì)粒(如圖)，將其與制備好的感受態(tài)農(nóng)桿菌混合，使外源DNA轉(zhuǎn)入細胞；經(jīng)適宜條件培養(yǎng)一段時間，再加入適宜濃度的________篩選出轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。(3)轉(zhuǎn)化番茄：取番茄子葉進行__________(填“消毒”或“滅菌”)處理后切段，再與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液進行共培養(yǎng)，一段時間后，取出子葉放在________上吸取多余菌液，再將子葉放在適宜的以____________培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)。(4)育成轉(zhuǎn)基因番茄：取上述處理的番茄子葉先經(jīng)________過程形成愈傷組織，將愈傷組織接種到含有特定激素的培養(yǎng)基上，就可以誘導其________成胚狀體，長出________，進而發(fā)育成完整的番茄植株。(5)轉(zhuǎn)基因番茄性狀的檢測和生產(chǎn)應用：為了檢測番茄中是否成功導入目的基因，可依據(jù)________________________設計引物進行PCR擴增，再用凝膠電泳技術(shù)進行檢測，進行此實驗的同時應以________作為陰性對照，以導入Ti質(zhì)粒的番茄作為陽性對照；已知某轉(zhuǎn)基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且這些金屬元素主要富集在根，生產(chǎn)應用時需對其定期拔除并實施無害處理，原因是______________________________________________________________________________________________________________________(答出2點即可)。答案(1)接種環(huán)搖床(2)卡那霉素(3)消毒無菌濾紙MS(4)脫分化再分化芽和根(5)T－DNA片段的(部分)序列未導入Ti質(zhì)粒的野生型番茄避免死亡后根等遺體被分解，Zn、Cd等再度返回土壤，造成二次污染；及時拔除植物后，可緩解Zn、Cd等隨食物鏈不斷富集的危害解析(1)取保存的農(nóng)桿菌菌落用接種環(huán)接種于相應的液體培養(yǎng)基中，并置于搖床中進行振蕩培養(yǎng)，使其大量繁殖；取適量菌液置于CaCl2溶液中處理，制得感受態(tài)農(nóng)桿菌。(2)由圖可知，載體上含有卡那霉素抗性基因和潮霉素抗性基因，但能在農(nóng)桿菌中表達的是卡那霉素抗性基因，因此，經(jīng)適宜條件培養(yǎng)一段時間，再加入適宜濃度的卡那霉素篩選出轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌。(3)取番茄子葉進行消毒處理，其目的是防止雜菌污染，而后切段，再與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌菌液進行共培養(yǎng)，一段時間后，取出子葉放在無菌濾紙上吸取多余菌液，再將子葉放在適宜的以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)配制的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，以便獲得無菌的外植體。(4)取上述處理的番茄子葉先經(jīng)脫分化過程形成愈傷組織，再在特定培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以誘導其再分化為胚狀體，長出芽和根，最后發(fā)育成完整的番茄植株。(5)為了檢測番茄中是否成功導入目的基因，可依據(jù)T－DNA片段的部分序列設計引物進行PCR擴增，再用凝膠電泳技術(shù)進行檢測，進行此實驗的同時應以未導入Ti質(zhì)粒的野生型番茄作為陰性對照，以導入Ti質(zhì)粒的番茄作為陽性對照。已知某轉(zhuǎn)基因番茄植株能大量吸收Zn、Cd等，且這些金屬元素主要富集在根，生產(chǎn)應用時需對其定期拔除并實施無害處理，這樣可以避免死亡后根等遺體被分解，這些元素再度返回土壤，造成二次污染；同時及時拔除植物后，能緩解Zn、Cd等隨食物鏈不斷富集的危害。4.(2024·湖南卷，21)百合具有觀賞、食用和藥用等多種價值，科研人員對其進行了多種育種技術(shù)研究?；卮鹣铝袉栴}：(1)體細胞雜交育種。進行不同種百合體細胞雜交前，先用________去除細胞壁獲得原生質(zhì)體，使原生質(zhì)體融合，得到雜種細胞后，繼續(xù)培養(yǎng)，常用________(填植物激素名稱)誘導愈傷組織形成和分化，獲得完整的雜種植株。(2)單倍體育種。常用____________的方法來獲得單倍體植株，鑒定百合單倍體植株的方法是____________________________________________________________________。(3)基因工程育種。研究人員從野生百合中獲得一個抵抗尖孢鐮刀菌侵染的基因pL，該基因及其上游的啟動子pL和下游的終止子結(jié)構(gòu)如圖a。圖b是一種Ti質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)示意圖，其中基因gus編碼GUS酶，GUS酶活性可反映啟動子活性。①研究病原微生物對L的啟動子pL活性的影響。從圖a所示結(jié)構(gòu)中獲取L，首先選用____________酶切，將其與相同限制酶酶切的Ti質(zhì)粒連接，再導入煙草。隨機選取3組轉(zhuǎn)基因成功的煙草(P1、P2和P3)進行病原微生物脅迫，結(jié)果如圖c。由此可知：三種病原微生物都能誘導pL的活性增強，其中________的誘導作用最強。②現(xiàn)發(fā)現(xiàn)栽培種百合B中也有L，但其上游的啟動子與野生百合不同，且抗病性弱。若要提高該百合中L的表達量，培育具有高抗病原微生物能力的百合新品種，簡要寫出實驗思路____________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)纖維素酶和果膠酶生長素和細胞分裂素(2)花藥(或花粉)離體培養(yǎng)利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數(shù)目(3)①HindⅢ、BamHⅠ交鏈格孢②利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL解析(1)因植物細胞細胞壁的成分主要是纖維素和果膠，因此獲得原生質(zhì)體的方法是用纖維素酶和果膠酶對植物細胞進行處理，得到原生質(zhì)體后使原生質(zhì)體融合，形成雜種細胞，再用生長素和細胞分裂素誘導愈傷組織形成和分化，從而獲得完整的雜種植株。(2)獲得單倍體植株的常用方法是花藥(花粉)離體培養(yǎng)；鑒定百合單倍體植株的方法是利用顯微鏡觀察根尖有絲分裂中期細胞中染色體的數(shù)目，如果染色體數(shù)目減少一半，則獲得的植株為單倍體植株。(3)①根據(jù)目的片段以及質(zhì)粒上限制酶的識別位點，若要獲得pL并連接到質(zhì)粒上，可選用限制酶HindⅢ、BamHⅠ進行酶切，以替換Ti質(zhì)粒中的啟動子，從而達到根據(jù)GUS酶活性反映啟動子活性的目的。根據(jù)圖c的結(jié)果可知，交鏈格孢的每一組轉(zhuǎn)基因煙草中的GUS酶活性都最高可確定其誘導作用最強。②欲培育具有高抗病原微生物百合新品種，可利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將百合B中L基因的啟動子替換為野生百合中L基因的啟動子pL。重點2PCR技術(shù)及應用【知識盤查】1.PCR技術(shù)原理與條件2.PCR技術(shù)的過程提醒可通過引物控制PCR擴增的基因片段，并在基因兩側(cè)引入限制酶識別序列。3.DNA的粗提取與鑒定4.DNA片段的電泳鑒定【曾經(jīng)這樣考】1.(2024·安徽卷，14)下列關(guān)于“DNA粗提取與鑒定”實驗的敘述，錯誤的是()A.實驗中如果將研磨液更換為蒸餾水，DNA提取的效率會降低B.利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNAC.DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，該原理可用于純化DNA粗提物D.將溶解的DNA粗提物與二苯胺試劑反應，可檢測溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)答案D解析若將研磨液更換為蒸餾水，則從細胞核中釋放出的DNA量會減少，從而會降低DNA提取的效率，A正確；由于DNA不溶于酒精，但某些蛋白質(zhì)溶于酒精，所以利用DNA和蛋白質(zhì)在酒精中的溶解度差異，可初步分離DNA，B正確；DNA在不同濃度NaCl溶液中溶解度不同，它能溶于2mol/L的NaCl溶液，利用該原理可純化DNA粗提物，C正確；二苯胺試劑可以用于鑒定DNA，不能檢測出溶液中是否含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，D錯誤。2.(2024·新課標卷，5)某種二倍體植物的P1和P2植株雜交得F1，F(xiàn)1自交得F2。對個體的DNA進行PCR檢測，產(chǎn)物的電泳結(jié)果如圖所示，其中①～⑧為部分F2個體，上部2條帶是一對等位基因的擴增產(chǎn)物，下部2條帶是另一對等位基因的擴增產(chǎn)物，這2對等位基因位于非同源染色體上。下列敘述錯誤的是()A.①②個體均為雜合體，F(xiàn)2中③所占的比例大于⑤B.還有一種F2個體的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果有3條帶C.③和⑦雜交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與②⑧電泳結(jié)果相同D.①自交子代的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果與④電泳結(jié)果相同的占1/2答案D解析由題圖可知，P1、P2為純合子，F(xiàn)1為雜合子，且兩對等位基因的遺傳符合自由組合定律，假設基因由上到下依此為A、a、B、b，則P1基因型為AAbb，P2基因型為aaBB，F(xiàn)1基因型為AaBb，據(jù)此分析選項。①基因型為AaBB，②基因型為Aabb，均為雜合體；F2中，③基因型為AABb，占比1/8，⑤基因型為AABB，占比1/16，③占比大于⑤，A正確；據(jù)圖分析，圖中缺少F2中基因型為aaBb對應的電泳圖像，其電泳結(jié)果為3條帶，分別為第2條帶、第3條帶和第4條帶，B正確；由題圖可知，③和⑦對應雜交類型為AABb×aabb，因此后代基因型為AaBb、Aabb，與②(基因型為Aabb)、⑧(基因型為AaBb)電泳結(jié)果相同，C正確；①基因型為AaBB，其自交后代基因型及比例為AABB∶AaBB∶aaBB＝1∶2∶1，④的基因型為aaBB，因此①自交子代與④電泳結(jié)果相同的占比1/4，D錯誤。3.(2024·山東卷，5)制備熒光標記的DNA探針時，需要模板、引物、DNA聚合酶等。在只含大腸桿菌DNA聚合酶、擴增緩沖液、H2O和4種脫氧核苷酸(dCTP、dTTP、dGTP和堿基被熒光標記的dATP)的反應管①～④中，分別加入如表所示的適量單鏈DNA，已知形成的雙鏈DNA區(qū)遵循堿基互補配對原則，且在本實驗的溫度條件下不能產(chǎn)生小于9個連續(xù)堿基對的雙鏈DNA區(qū)。能得到帶有熒光標記的DNA探針的反應管有()反應管加入的單鏈DNA①5′—GCCGATCTTTATA—3′3′—GACCGGCTAGAAA—5′②5′—AGAGCCAATTGGC—3′③5′—ATTTCCCGATCCG—3′3′—AGGGCTAGGCATA—5′④5′—TTCACTGGCCAGT—3′A.①② B.②③C.①④ D.③④答案D解析①反應管中的兩種單鏈DNA部分互補配對：?則無延伸產(chǎn)物，②反應管中的1種單鏈DNA自身進行部分互補配對，，新合的“…”部分，無熒光標記的dATP，①②錯誤；③反應管中兩種單鏈DNA部分互補配對，?新合成的“…”部分有帶熒光標記的dATP，④反應管中1種單鏈DNA部分配對，?新合成的“…”部分有帶熒光標記的dATP，且③④組雙鏈DNA區(qū)都大于9個，③④正確。故選D。4.(2023·江蘇卷，22)為了將某納米抗體和綠色熒光蛋白基因融合表達，運用重組酶技術(shù)構(gòu)建質(zhì)粒，如圖1所示。請回答下列問題：(1)分別進行PCR擴增片段F1與片段F2時，配制的兩個反應體系中不同的有________，擴增程序中最主要的不同是________。(2)有關(guān)基因序列如圖2。引物F2－F、F1－R應在下列選項中選用________。EGFP基因序列：5′ATGGTGAGCAAGGGC—GACGAGCTGTACAAG3′AnB1基因序列：5′CATGTCCAGCTGCAG—CCAAAACCACAACCA3′圖2A.ATGGTG——CAACCA B.TGGTTG——CACCATC.GACGAG——CTGCAG D.CTGCAG——CTCGTC(3)將PCR產(chǎn)物片段與線性質(zhì)粒載體混合后，在重組酶作用下可形成環(huán)化質(zhì)粒，直接用于轉(zhuǎn)化細菌。這一過程與傳統(tǒng)重組質(zhì)粒構(gòu)建過程相比，無需使用的酶主要有________。(4)轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌需采用含有抗生素的培養(yǎng)基篩選，下列敘述錯誤的有________。A.稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落B.抗性平板上未長出菌落的原因一般是培養(yǎng)基溫度太高C.抗性平板上常常會出現(xiàn)大量雜菌形成的菌落D.抗性平板上長出的單菌落無需進一步劃線純化(5)為了驗證平板上菌落中的質(zhì)粒是否符合設計，用不同菌落的質(zhì)粒為模板，用引物F1－F和F2－R進行了PCR擴增，質(zhì)粒P1～P4的擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖3。根據(jù)圖中結(jié)果判斷，可以舍棄的質(zhì)粒有________。(6)對于PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果符合預期的質(zhì)粒，通常需進一步通過基因測序確認，原因是______________________________________________________________________________________________________________________________。答案(1)模板、引物退火溫度(2)CD(3)限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶(4)ABC(5)P3、P4(6)電泳只能顯示擴增片段的大致長度，不能顯示精準的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)DNA堿基序列解析(1)不同的PCR反應體系中，模板和引物是不同的；擴增程序中依據(jù)不同引物設置不同的退火溫度是最重要的環(huán)節(jié)，恰當?shù)剡x擇退火溫度，盡量避免引物與模板的非特異性結(jié)合，以保證目的產(chǎn)物的有效擴增。而對于延伸時間而言，以常用的TaqDNA聚合酶為例，催化DNA延伸的速度為1000～2000bp/min，通常在實驗室中可根據(jù)目的片段大小在30s～2min的時長內(nèi)大致設置延伸時間，一般不需要精確控制。(2)對于引物F2－F、F1－R，根據(jù)圖中信息分析，應該包含EGFP尾部和AnB1頭部的序列，且反向互補。因此，應選擇引物C和D。(3)根據(jù)圖中示意的同源重組過程，兩個插入片段與線性載體在重組酶作用下，可形成環(huán)狀質(zhì)粒，直接轉(zhuǎn)化細菌，這一過程省去了傳統(tǒng)質(zhì)粒構(gòu)建過程中酶切、連接兩個過程，所以無需使用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶。(4)“稀釋涂布平板需控制每個平板30～300個菌落”是微生物計數(shù)的實驗步驟，與抗性平板篩選的目的完全不同，A錯誤；涂布平板時，培養(yǎng)基已凝固，不會燙死細菌，抗性平板上沒有出現(xiàn)菌落，最常見的原因是未能有效實現(xiàn)重組質(zhì)粒構(gòu)建，或未能進行有效轉(zhuǎn)化，導致抗性平板上未長出帶有抗性質(zhì)粒的菌落，B錯誤；由于篩選平板中含有抗生素，在正常的無菌操作過程中，不會出現(xiàn)大量的雜菌污染，C錯誤；單菌落無需進行純化，如攜帶非目標質(zhì)粒，可通過鑒定排除，D正確。(5)結(jié)合圖1中的設計目標，從PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果判斷：P3無目的片段，P4產(chǎn)物片段大小不符，故P3、P4可直接丟棄。而P1、P2產(chǎn)物大小與理論值相近，需進一步分析確認。(6)電泳條帶依據(jù)其和參照分子(Marker)的相對位置，僅能顯示擴增片段的大致長度，即不能顯示精準的DNA堿基數(shù)量，也不能呈現(xiàn)DNA堿基序列，必須通過DNA測序最終確認構(gòu)建的質(zhì)粒符合設計?！具€會這樣考】1.(2024·華師一附中調(diào)研)中天楊是由我國科學家采用生物轉(zhuǎn)基因技術(shù)，歷經(jīng)8年時間培育成功的抗鹽堿、耐干旱的楊樹新品種。該品種以八里莊楊為實驗材料，經(jīng)轉(zhuǎn)mtl－D基因培育獲得。如圖為培育“中天楊”的操作流程，①～⑥表示操作過程，該過程中可能用到的限制酶如表所示。注：Ti質(zhì)粒中的Tetr為四環(huán)素抗性基因，Ampr為氨芐青霉素抗性基因。限制酶BclⅠEcoRⅠXbaⅠSau3AⅠBamHⅠ切割位點T↓GATCAG↓AATTCT↓CTAGA↓GATCG↓GATCC(1)過程①需要的酶是________，過程②需要的工具酶是________。采用PCR技術(shù)擴增目的基因時，在PCR反應體系需加入引物，引物的作用是____________________，若目的基因擴增3代，則共用引物________個。PCR完成以后，常采用________法來鑒定PCR的產(chǎn)物。(2)培育轉(zhuǎn)基因楊樹的核心工作是________________，在進行該工作時，應在mtl－D基因的兩側(cè)添加限制酶________的識別序列。(3)將目的基因?qū)胧荏w細胞除圖示方法外，還有____________。為了確認目的基因在植物細胞中是否成功表達，從分子水平通常是用________法進行檢測。答案(1)逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶限制酶和DNA連接酶使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸14瓊脂糖凝膠電泳(2)基因表達載體的構(gòu)建XbaⅠ、BclⅠ(3)花粉管通道法抗原—抗體雜交解析(1)過程①以RNA為模板合成DNA并進行PCR，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶和耐高溫的DNA聚合酶。過程②是將目的基因與Ti質(zhì)粒進行連接，需要限制酶切割目的基因和Ti質(zhì)粒，然后利用DNA連接酶將二者進行連接。采用PCR技術(shù)擴增目的基因時，在PCR反應體系需加入引物，引物的作用是使DNA聚合酶能夠從引物的3′端開始連接脫氧核苷酸，若目的基因擴增3代，則共用引物14個。PCR完成以后，常采用瓊脂糖凝膠電泳法來鑒定PCR的產(chǎn)物。(2)基因表達載體的構(gòu)建是基因工程的核心工作，在進行基因表達載體的構(gòu)建時，應選擇兩種限制酶切割目的基因和Ti質(zhì)粒，分析Ti質(zhì)粒上的酶切割位點，首先排除BamHⅠ和EcoRⅠ，由Sam3AⅠ的酶切割位點可知，該酶可以將復制原點切開，故在mtl－D基因的兩側(cè)添加限制酶XbaⅠ、BclⅠ的識別序列。(3)圖中利用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法將目的基因?qū)胧荏w細胞，除此方法外，還有花粉管通道法等。為了確認目的基因在植物細胞中是否成功表達，通常用抗原—抗體雜交法從分子水平進行檢測。2.(2024·河南名校聯(lián)盟)如圖是構(gòu)建基因表達載體的示意圖，回答下列問題：(1)基因工程操作中的核心步驟是____________。重組質(zhì)粒載體的核心部件有目的基因、啟動子、________、________、復制原點等。(2)引物是一小段能與________堿基互補配對的單鏈DNA。圖中合成引物時，在引物5′端添加限制酶識別序列的原因是__________________________________________________________________。(3)PCR擴增目的基因需在一定的緩沖溶液中進行，反應體系中需添加模板DNA、引物、耐高溫的DNA聚合酶和________等。PCR反應緩沖溶液中一般要添加Mg2＋，以激活________。PCR反應完成后，常采用________技術(shù)來鑒定PCR的產(chǎn)物。(4)構(gòu)建基因表達載體時，選用雙酶切切割質(zhì)粒載體和目的基因的目的有_______________________________________________________(寫出兩點)，圖中的T4DNA連接酶能使目的基因片段和質(zhì)粒載體片段之間形成________鍵。答案(1)構(gòu)建基因表達載體終止子標記基因(2)目的基因(或DNA母鏈)使擴增的目的基因含有限制酶的識別序列，便于切割后與載體連接并且不影響目的基因的復制(3)4種脫氧核苷酸DNA聚合酶瓊脂糖凝膠電泳(4)保證目的基因片段插入的方向正確、防止質(zhì)粒載體或目的基因的自連磷酸二酯解析(1)構(gòu)建基因表達載體是基因工程操作中的核心步驟。一個完整的基因表達載體，必須有啟動子、終止子、目的基因、標記基因和復制原點等。(2)引物是根據(jù)目的基因的一小段DNA序列人工合成的。在引物5′端添加限制酶識別序列，一方面便于切割目的基因后與載體連接，另一方面又不影響目的基因的擴增，因為DNA分子復制時，子鏈的延伸是從引物的3′端開始的。(3)PCR反應體系中有模板DNA、引物、耐高溫的DNA聚合酶和原料(4種脫氧核苷酸)等。DNA聚合酶需要Mg2＋的激活。PCR產(chǎn)物中有多種類型的DNA分子，常采用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)來鑒定PCR的產(chǎn)物。(4)對目的基因和質(zhì)粒同時進行雙酶切，能夠保證目的基因片段插入的方向正確，且可以防止質(zhì)粒載體或目的基因的自連?；蚬こ讨械腄NA連接酶，能使目的基因片段和質(zhì)粒載體片段之間形成磷酸二酯鍵。限時練24賦予生物新的遺傳特性的基因工程(時間：40分鐘分值：50分)【精準強化】重點1基因工程和蛋白質(zhì)工程1.(2024·廣西南寧市摸底)鐮狀細胞貧血是一種常染色體隱性遺傳病，由正常血紅蛋白基因(HbA)突變?yōu)殓牋罴毎氀?Hbs)引起，HbA和Hbs的某片段如圖甲。對胎兒進行基因檢測的主要原理是：用MstⅡ限制酶處理PCR擴增后的DNA；加熱使被酶切的DNA片段解旋，用熒光標記的CTGACTCCT序列與其雜交；凝膠電泳分離。圖乙是凝膠電泳后熒光出現(xiàn)的三種可能性?；卮鹣铝袉栴}：(1)圖甲為基因HbA和Hbs的部分片段，據(jù)圖可知，鐮狀細胞貧血是基因中發(fā)生________導致的。基因突變具有不定向性，可產(chǎn)生________基因。(2)胎兒c的基因型為________，與胎兒c具有相同基因型的一對夫婦生下患鐮狀細胞貧血女兒的概率為________。(3)基因治療是治療鐮狀細胞貧血最有效的方法，治療時要構(gòu)建含HbA的基因表達載體，構(gòu)建基因表達載體首先需要用同一種限制酶切割HbA和質(zhì)粒，目的是________________________________________________________________，再用DNA連接酶連接，DNA連接酶的主要功能是______________________。構(gòu)建基因表達載體的目的是______________________________________________________________________________________________________________。答案(1)堿基替換一個以上的等位(2)HbAHbs1/8(3)產(chǎn)生相同的末端將切下來的雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵(合理即可)讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時能夠使目的基因表達并發(fā)揮作用解析(1)據(jù)圖甲分析可知，鐮狀細胞貧血是相應基因中發(fā)生堿基替換的結(jié)果?；蛲蛔兙哂胁欢ㄏ蛐?，可以產(chǎn)生一個以上的等位基因。(2)(3)用同一種限制酶切割HbA和質(zhì)粒，目的是讓HbA和質(zhì)粒形成相同的末端。之后再用DNA連接酶連接，DNA連接酶的主要功能是將切下來的雙鏈DNA片段“縫合”起來，恢復被限制酶切開的磷酸二酯鍵。構(gòu)建基因表達載體的目的是讓目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且遺傳給下一代，同時能夠使目的基因表達并發(fā)揮作用。2.(2024·南京市調(diào)研)PSMA3是蛋白酶體的重要組成成分之一，與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系。為探尋PSMA3與肝細胞癌(HCC)的關(guān)系，科研人員通過構(gòu)建含人PSMA3基因的重組腺病毒(pAd/PSMA3)并開展了相關(guān)研究，以期為HCC早期診斷和治療奠定基礎(chǔ)。如圖為重組腺病毒的構(gòu)建流程，其中GFP為綠色熒光蛋白基因。請回答下列問題。限制酶識別序列和酶切位點限制酶識別序列和酶切位點PacⅠTTAAT↓TAABclⅠT↓GATCAPmeⅠGTTT↓AAACEcoRⅤGAT↓ATCSalⅠG↓TCGACSau3AⅠ↓GATC(1)過程①以提取的總RNA為模板，在__________酶的作用下獲得PSMA3的cDNA，該cDNA與人體細胞核中PSMA3基因在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別是該cDNA沒有____________________。(2)為防止過程②中PSMA3基因與質(zhì)粒1錯誤連接，可在PSMA3基因的上游引物和下游引物的5′端分別添加限制酶________________的識別序列。(3)過程④為同源重組，該過程首先需要用核酸外切酶從線性化DNA分子一條鏈的末端按3′→5′的方向順次水解若干個磷酸二酯鍵，其目的是形成________末端，再經(jīng)________酶的作用形成重組腺病毒載體。(4)過程⑥常用脂質(zhì)體包裹DNA片段，目的是_____________________________________________________________________________________________。轉(zhuǎn)染后，可通過熒光顯微鏡觀察________基因的表達強度來初步篩選目標239A細胞。答案(1)逆轉(zhuǎn)錄啟動子、終止子、內(nèi)含子(2)SalⅠ、EcoRⅤ(順序不能顛倒)(3)黏性DNA連接(4)促進目的DNA片段進入239A細胞綠色熒光蛋白(GFP)解析(1)以RNA為模板合成DNA的過程稱為逆轉(zhuǎn)錄，該過程需要逆轉(zhuǎn)錄酶參與。與人體細胞核中的PSMA3基因相比，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲得的PSMA3的cDNA在結(jié)構(gòu)上缺少啟動子、終止子和內(nèi)含子。(2)應將PSMA3基因插到質(zhì)粒1的啟動子和終止子之間，為防止目的基因和質(zhì)粒發(fā)生自身環(huán)化和目的基因在質(zhì)粒中反向連接，需要進行雙酶切。由題圖可知，質(zhì)粒1啟動子和終止子之間含有限制酶SalⅠ、EcoRⅤ和Sau3AⅠ的識別序列，且質(zhì)粒1中還含有限制酶BclⅠ的識別序列。由題表知，BclⅠ的識別序列和酶切位點為T↓GATCA，Sau3AⅠ的識別序列和酶切位點為↓GATC，若使用限制酶Sau3AⅠ對質(zhì)粒1進行切割，會將終止子切下來，因此不能使用限制酶Sau3AⅠ對質(zhì)粒1進行切割。經(jīng)分析可知，應選擇限制酶SalⅠ和EcoRⅤ對質(zhì)粒1進行酶切，又知質(zhì)粒1中限制酶SalⅠ的識別序列位于限制酶EcoRⅤ識別序列的上游，因此，為了使PSMA3基因與質(zhì)粒1正確連接，可在PSMA3基因的上游引物和下游引物的5′端分別添加限制酶SalⅠ和EcoRⅤ的識別序列。(3)據(jù)題表可知，過程③是用限制酶PmeⅠ切割的，形成的是平末端。過程④為同源重組，該過程首先需要用核酸外切酶從線性化DNA分子一條鏈的末端按3′→5′的方向順次水解若干個磷酸二酯鍵，形成黏性末端，再經(jīng)DNA連接酶的作用形成重組腺病毒載體。(4)過程⑥是脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，常用脂質(zhì)體包裹DNA片段，以促進目的DNA片段進入239A細胞。轉(zhuǎn)染后，可通過熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白基因(GFP基因)的表達強度來初步篩選目標239A細胞。重點2PCR技術(shù)及應用3.(2024·衡陽八中質(zhì)檢)科學家用抗旱基因培育出了耐旱玉米新品系，為解決我國糧食問題做出了重要貢獻。若測得某耐旱基因(mt1D)編碼鏈首端到末端(其中一條鏈)的序列為5′—ATCTACGCGCTCATCCG…(省略3n個核苷酸序列)…CGCAGCAATGAGTAGCG—3′。下圖1為構(gòu)建重組質(zhì)粒的過程示意圖，BamHⅠ、BclⅠ、SmaⅠ、Sau3AⅠ為限制酶(四種酶的識別序列詳見表)，箭頭表示轉(zhuǎn)錄方向?；卮鹣铝袉栴}。限制酶識別序列及切割位點(5′→3′)BamHⅠG↓GATCCBclⅠT↓GATCASmaⅠCCC↓GGGSau3AⅠ↓GATCQ1：5′—GGATCCCGCAGCAA—3′Q2：5′—CCCGGGATCTACGC—3′Q3：5′—TGATCCATCTACGC—3′Q4：5′—TGATCACGCTACTC—3′圖2(1)為獲取更多mt1D基因，可采用PCR技術(shù)擴增，在反應體系中除加入引物、dNTP、緩沖液、Mg2＋外，還需要加入____________________。某同學設計了如下六種PCR引物，其中適合選用的一對引物是________(選填序號)。①5′—GACTACTCGCGCATCTA—3′②5′—ATCTACGCGCTCATCCG—3′③5′—GCGATGAGTAACGACGC—3′④5′—CGCTACTCATTGCTGCG—3′⑤5′—TAGATGCGCGAGTAGGC—3′⑥5′—CGCAGCAATGAGTAGCG—3′(2)若PCR反應得到的非特異性擴增產(chǎn)物偏多，從引物設計和溫度控制角度考慮，主要原因可能是______________________________________________。(3)為將圖中質(zhì)粒A和mt1D基因正確連接構(gòu)建重組質(zhì)粒B，設計mt1D基因的引物時，應在兩種引物的5′端分別添加__________限制酶的識別序列，選用__________限制酶切割質(zhì)粒A，酶切后的載體和目的基因片段通過____________酶作用后獲得重組質(zhì)粒。為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的受體細胞，應首先在篩選平板培養(yǎng)基中添加________，再將平板上長出的菌落通過影印平板法接種到添加________的平板培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)觀察。(4)若從平板上長出的菌落中提取重組質(zhì)粒B，利用Sau3AⅠ進行完全酶切，最多可以得到________種大小不同的DNA片段。(5)圖2是對重組質(zhì)粒測序所得到的部分序列，若目的基因與質(zhì)粒正確連接，則圖中M連接處的序列正確的是________(填序列編號)。答案(1)模板、耐高溫的DNA聚合酶②④(2)復性溫度低，引物設計不恰當(合理即可)(3)BamHⅠ、SmaⅠBclⅠ、SmaⅠT4DNA連接四環(huán)素氨芐青霉素(4)3(5)Q3解析(1)該耐旱基因(mt1D)編碼鏈首端到末端(其中一條鏈)的序列為5′—ATCTACGCGCTCATCCG…(省略3n個核苷酸序列)…CGCAGCAATGAGTAGCG—3′。設計引物時，其中一種引物需要與編碼鏈3′端的一段序列發(fā)生堿基互補配對，另一種引物需要與模板鏈3′端的部分序列發(fā)生堿基互補配對，六種PCR引物中可選用的引物是②④。(2)擴增時復性溫度過低，可能會導致引物與非目的基因序列發(fā)生結(jié)合，從而擴增出不同長度的DNA分子，出現(xiàn)多條條帶。PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示，除目的基因條帶外，還有非特異性條帶，從引物的角度考慮可能的原因是引物設計不合理，設計的引物可與非目的基因序列發(fā)生互補配對，從而擴增出非目的基因序列，產(chǎn)生非特異性條帶。(3)為將圖中質(zhì)粒A和mt1D基因正確連接構(gòu)建重組質(zhì)粒B，設計mt1D基因的引