T-CASME 1362-2024 細(xì)胞外囊泡探針?lè)肿雍铣杉夹g(shù)規(guī)范

ICS07.080CCSA40CASMETechnicalspecificationsforthesynthesisofextracellularvesicleprobemoleculesIT/CASME1362—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由維思克思生物科技（武漢）有限公司提出。本文件由中國(guó)中小商業(yè)企業(yè)協(xié)會(huì)歸口。本文件起草單位：維思克思生物科技（武漢）有限公司、致生源健康科技（武漢）有限公司、原點(diǎn)生物科技（武漢）有限公司、武漢固德生物醫(yī)療科技有限公司。本文件主要起草人：付洋波、雷祖超、曾思遠(yuǎn)、宋波、李慶芳、張俊、林雷鳴。1T/CASME1362—2024細(xì)胞外囊泡探針?lè)肿雍铣杉夹g(shù)規(guī)范本文件提出了細(xì)胞外囊泡探針?lè)肿雍铣杉夹g(shù)的術(shù)語(yǔ)和定義、縮略詞、基本要求、探針合成方法、標(biāo)記條件驗(yàn)證、生物安全及防污染措施等方面的內(nèi)容。本文件適用于細(xì)胞外囊泡探針?lè)肿拥暮铣梢约胺椒ǖ尿?yàn)證。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB19489實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T27401實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范動(dòng)物檢疫YY/T1441體外診斷醫(yī)療器械性能評(píng)估通用要求3術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1細(xì)胞外囊泡extracellularvesicles一種由細(xì)胞分泌的脂質(zhì)雙層囊泡，包裹著細(xì)胞內(nèi)的生物活性分子，具有傳遞信息的功能。3.2探針?lè)肿觩robemolecule基于N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）與氨基共價(jià)鍵合激發(fā)熒光基團(tuán)而標(biāo)記細(xì)胞外囊泡，用于細(xì)胞外囊泡在體內(nèi)體外研究中準(zhǔn)確定位和示蹤。4縮略語(yǔ)下列縮略語(yǔ)適用于本文件。化合物1：1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole化合物2：3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium化合物3:（E）-3-（2-carboxyethy5基本要求5.1探針?lè)肿釉O(shè)計(jì)原則5.1.1特異性探針?lè)肿討?yīng)具有高度的特異性，能夠特異性結(jié)合細(xì)胞外囊泡或其他膜結(jié)構(gòu)。5.1.2親和力探針?lè)肿討?yīng)與細(xì)胞外囊泡具有適當(dāng)?shù)挠H和力，以確保準(zhǔn)確定位和示蹤。5.1.3穩(wěn)定性探針?lè)肿討?yīng)在體內(nèi)各種pH條件下保持穩(wěn)定，保持較高的熒光強(qiáng)度。5.1.4生物相容性2T/CASME1362—2024探針?lè)肿討?yīng)具有良好的生物相容性，不會(huì)對(duì)生物體或細(xì)胞產(chǎn)生毒性或不良影響。5.1.5可檢測(cè)性探針?lè)肿討?yīng)具備可檢測(cè)的性質(zhì)，如熒光、放射性或電化學(xué)活性等，以便于檢測(cè)和定量分析。5.1.6水溶性如探針?lè)肿佑糜谏矬w液或細(xì)胞培養(yǎng)基等水性環(huán)境，應(yīng)具有良好的水溶性。5.1.7化學(xué)穩(wěn)定性探針?lè)肿討?yīng)在儲(chǔ)存和使用過(guò)程中保持化學(xué)穩(wěn)定性，避免分解或變性。5.1.8反應(yīng)條件設(shè)計(jì)的探針?lè)肿討?yīng)考慮反應(yīng)條件的兼容性，如酸堿度、溫度等。5.1.9成本效益在滿足需求的前提下，探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)應(yīng)考慮成本效益，確保其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。5.1.10可重復(fù)性探針?lè)肿拥脑O(shè)計(jì)應(yīng)確保其在不同實(shí)驗(yàn)條件下具有良好的可重復(fù)性。5.2合成路線選擇和優(yōu)化5.2.1合成路線的選擇5.2.1.1選擇的合成路線應(yīng)具有可行性，包括反應(yīng)條件、試劑易獲得性、操作復(fù)雜度等方面的因素。5.2.1.2優(yōu)先選擇高產(chǎn)率的合成路線，以提高合成效率和經(jīng)濟(jì)效益。5.2.1.3選擇具有高選擇性的合成路線，盡量減少副反應(yīng)的發(fā)生，提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度。5.2.1.4考慮合成路線對(duì)環(huán)境的影響，盡量選擇低污染、綠色環(huán)保的合成方法。5.2.1.5應(yīng)確保合成路線在操作過(guò)程中具有較高的安全性，避免使用危險(xiǎn)試劑或涉及高風(fēng)險(xiǎn)操作。5.2.2合成路線的優(yōu)化5.2.2.1通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)溫度、時(shí)間、溶劑等反應(yīng)條件，以提高反應(yīng)效率、產(chǎn)率和選擇性。5.2.2.2選擇合適的催化劑可加速反應(yīng)速率、提高選擇性，并降低反應(yīng)能耗。5.2.2.3盡量簡(jiǎn)化合成路線中的反應(yīng)步驟，減少中間產(chǎn)物的合成和分離，提高整體合成效率。5.2.2.4選擇適當(dāng)?shù)娜軇┛梢蕴岣叻磻?yīng)物的溶解性，促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，并便于后續(xù)的分離和純化。5.2.2.5優(yōu)化反應(yīng)物的投料比，提高反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)率。5.2.2.6優(yōu)化后處理步驟，如提純方法、結(jié)晶條件等，提高產(chǎn)物的純度和收率。5.3探針合成技術(shù)綜合性能評(píng)估應(yīng)按照YY/T1441進(jìn)行性能評(píng)估6探針合成方法6.1探針合成流程圖探針合成流程圖如圖1所示。標(biāo)引序號(hào)說(shuō)明：1——1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indole2——3-（2-carboxyethyl）-1,1,2-trimethyl-1H-benzo[e]indol-3-ium3——（E）-3-（2-carboxyethy3T/CASME1362—2024圖1探針合成流程圖6.2探針的合成6.2.1化合物2的合成6.2.1.1將1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚（3.13g,15.0mmoL）、3-溴丙酸（2.43g,16.0mmoL）混合于5.0mL甲苯中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下100℃回流3h，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完成。6.2.1.2將反應(yīng)溶液逐漸冷卻至室溫后，反應(yīng)液逐滴加入至乙醚（150mL）溶劑中，有大量粉末顆粒析出，經(jīng)過(guò)過(guò)濾收集粉末，用冷卻的乙醚（50mL）洗滌，得到絳紅色固體粉末即化合物2（4.11g，產(chǎn)率76。HRMS（ESI,m/z）Calcd.for[C18H20BrNO2-Br-],282.1489；Found,282.1613。6.2.2化合物3的合成6.2.2.1將化合物2（722.0mg,2.0mmoL）、4-二苯胺基苯甲醛（546.0mg,2.0mmol）混合于5.0mL乙醇中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80℃回流9h，TLC監(jiān)測(cè)至反應(yīng)完成。6.2.2.2將反應(yīng)溶液逐漸冷卻至室溫后逐滴加入至乙醚（150mL）溶劑中，有大量粉末顆粒析出，過(guò)Calcd.for[C37H33BrN2O2-Br-],537.2537；Found,537.2604。7探針標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的條件驗(yàn)證7.1探針標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的原理探針標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的原理如圖2所示。圖2探針標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的原理圖7.2探針標(biāo)記細(xì)胞外囊泡的過(guò)程EDC（1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽）活化該探針上的羧基，促使其與NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）形成含有N-羥基琥珀酰亞胺酯的中間化合物，N-羥基琥珀酰亞胺酯再不可逆地與膜上蛋白的氨基特異性共價(jià)結(jié)合形成酰胺鍵，進(jìn)而激發(fā)熒光基團(tuán)進(jìn)行顯色反應(yīng)。7.3探針標(biāo)記參數(shù)測(cè)定7.3.1使用濃度約為50“M的探針與細(xì)胞外囊泡在室溫下避光染色30min。7.3.2設(shè)置無(wú)細(xì)胞外囊泡的空白對(duì)照。7.3.3將探針與空白對(duì)照在室溫避光染色30min。7.3.4通過(guò)空白對(duì)照與細(xì)胞外囊泡結(jié)合后熒光信號(hào)的增強(qiáng)來(lái)確認(rèn)標(biāo)記參數(shù)。4T/CASME1362—20247.4探針最適使用濃度的篩選7.4.1確定受試細(xì)胞（如懸浮細(xì)胞SKM1）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。7.4.2吸取約2.0×106個(gè)受試細(xì)胞（如SKM1細(xì)胞）于15mL離心管中。7.4.3用離心機(jī)離心（參數(shù)設(shè)置為5000rpm）。7.4.42%多聚甲醛室溫固定15min。7.4.51%BSA/PBS封閉。7.4.6PBS重懸，均分到8個(gè)流式管中，分別使用終濃度0μM，1μM，2μM，5μM，10μM，50μM，100μM的探針于室溫下避光染色30min，100mM甘氨酸中和，PBS洗滌一次，100μLPBS重懸上機(jī)檢測(cè)。7.4.7與陰性對(duì)照（探針濃度為0μM）相比，使用50μM和100μM的探針標(biāo)記細(xì)胞峰值偏移較大，結(jié)果應(yīng)如圖3所示，確定使用濃度為10μM～100μM的探針均能對(duì)細(xì)胞進(jìn)行較好的標(biāo)記，10μM探針在實(shí)驗(yàn)條件中就已經(jīng)能很好區(qū)分標(biāo)記細(xì)胞，滿足流式檢測(cè)需求。圖3探針標(biāo)記細(xì)胞的熒光峰值7.5不同pH對(duì)探針標(biāo)記產(chǎn)物光譜性質(zhì)的驗(yàn)證7.5.1以受試細(xì)胞（如懸浮細(xì)胞SKM1和KG1a）為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，分別吸取約1.0×105個(gè)受試細(xì)胞（如SKM1，KG1a細(xì)胞）于15mL離心管中，2%多聚甲醛固定，均分兩份，分別使用10μM的探針和10μM的常規(guī)染料CFSE在室溫下對(duì)兩種細(xì)胞分別避光染色30min后，等量添加至含有不同pH緩沖液的全黑96孔板中，上機(jī)檢測(cè)。7.5.2與常規(guī)染料CFSE對(duì)比。新合成的探針和