DB37T 3105-2018 向日葵種子純度蛋白電泳檢測標(biāo)準(zhǔn)　

DB37DB37/T3105—2018向日葵種子純度蛋白電泳檢測標(biāo)準(zhǔn)山東省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布IDB37/T3105—2018本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由山東省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)、北京德農(nóng)種業(yè)有限公司。本標(biāo)準(zhǔn)起草人：張春慶、趙洪春、鄭建鵬、溫大興、李巖。本標(biāo)準(zhǔn)為首次發(fā)布。1DB37/T3105—2018本規(guī)程適用于向日葵品種及雜交種種子的純度室內(nèi)的快速鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB3543種子檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)程GB20464農(nóng)作物種子標(biāo)簽通則3術(shù)語和定義3.1雜交種各種直接用于生產(chǎn)的雜交向日葵一代種子。3.2品種純度品種在特征特性方面典型一致的程度，用本品種的種子數(shù)占供檢本作物樣品種子數(shù)的百分率表示。3.3標(biāo)準(zhǔn)樣品能夠充分代表種或品種特征特性的種子樣品，或具備指定特征、特性樣品。4原理4.1不同品種遺傳組成不同，在種子形成時(shí)期合成的蛋白質(zhì)不同。4.1.1不同的蛋白質(zhì)由于分子大小、形狀不同，在一定的pH條件下所帶的電荷多少不同，因此在電場作用下，在凝膠中移動的快慢不同，通過電泳可以把不同的蛋白質(zhì)區(qū)分開，近而區(qū)分不同的親本和雜交4.1.2利用該電泳技術(shù)，雜交種具有不育系和恢復(fù)系的雙親譜帶，雙親有差異蛋白譜帶是雜交種純度250之間細(xì)分為50等份作為標(biāo)尺，50以下的部分按該標(biāo)尺進(jìn)行區(qū)分，讀取泳道內(nèi)所有蛋白指紋所處位置的數(shù)值，記為蛋白質(zhì)譜帶名稱。圖1蛋白質(zhì)譜帶命名示意圖5儀器與試劑單粒種子磨粉器，天平(感量0.0001g,0.001g),移液管(10mL),離心管(1.5mL),離心管丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，冰醋酸，過硫酸銨，尿素，四甲基乙二胺(TEMED),三氯乙酸，考馬斯亮藍(lán)R-250,十二烷基磺酸鈉(SDS),無水乙醇(所用試劑均為分析純，所用水均為去離子水)。6溶液稱取2gSDS倒入100mL燒杯中，加入去離子水溶解，加去離子水定容至100mL,轉(zhuǎn)入試劑瓶，4℃貯存?zhèn)溆谩?DB37/T3105—2018稱取18g尿素，加約50mL去離子水溶解后加12mL冰乙酸，3mL四甲基乙二胺，7.5mL2%SDS,加去離子水定容至100mL,轉(zhuǎn)入試劑瓶并加入0.05g甲基綠，4℃貯存?zhèn)溆谩?.3凝膠溶液稱取50g丙烯酰胺、50g尿素、1.0g甲叉雙丙烯酰胺，加去離子水溶解后加入15mL冰乙酸，0.10g硫酸亞鐵，加去離子水定容至500mL,6.4催化劑溶液稱取1.75g過硫酸銨，加去離子水溶解并定容至50mL,4℃短期貯存。6.5電極緩沖液6.6染色液7操作程序7.1蛋白質(zhì)提取7.1.1從送驗(yàn)樣品中隨機(jī)數(shù)取向日葵種子200粒，將種子去殼后用單粒種子磨粉器壓碎，放入1.5mL離心管中，按向日葵種子與提取液質(zhì)量體積比1:6加蛋白提取液、搖勻，25℃提取20min,用離心機(jī)4000g離心4min,取上清液備用。7.1.2與標(biāo)簽值比較時(shí)，為了減少工作量，可以順序測定50粒/次，將測定結(jié)果與標(biāo)簽值比較是否在7.2凝膠制備將洗凈晾干的玻璃板采用水平平板灌膠的方式組裝玻璃板，用鐵夾固定，取40mL凝膠溶液于燒杯3min聚合后將樣品梳拔出，吸出樣品槽中的水分，將玻璃板固定在電泳槽內(nèi)。7.3點(diǎn)樣用微量移液器取離心后的樣品上清液30μL加入樣品槽，每加一個樣品后，用去離子水清洗移液器加樣完畢后，加入2%電極緩沖液，上槽電極緩沖液要沒過矮玻璃板，下槽電極緩沖液要沒過玻璃7.5卸板、染色倒出電極液，卸開電泳槽并用油灰刀取出膠片，置染色液中染色12h左右。7.6電泳分析4DB37/T3105—2018親本的為自交粒。品種粒數(shù)(M),并按式計(jì)算電泳測定值X%(保留一位小數(shù))。X