分子生物學課件PCR

PCR:polymerasechainreaction聚合酶鏈式反應

2021/6/271

PCR技術是一種體外模擬體內DNA復制過程的核酸擴增技術。它是以待擴增的雙鏈DNA為模板，以一對人工合成的寡核苷酸為引物，以四種dNTP為底物，通過耐高溫DNA聚合酶的酶促作用，經(jīng)過“變性、退火、延伸”三步反應的循環(huán)快速特異地擴增出特定的DNA片斷。

2021/6/272PCR技術的基本原理

由“高溫變性、低溫退火和適溫延伸反應”組成一個周期，循環(huán)進行，使目的基因得以迅速擴增。2021/6/273模板DNA95℃PCR循環(huán)過程2021/6/27450℃引物1引物2DNA引物PCR循環(huán)過程2021/6/275引物1引物2DNA引物72℃Taq酶Taq酶PCR循環(huán)過程2021/6/276第1輪結束95℃第2輪開始PCR循環(huán)過程2021/6/27772℃TaqTaqTaqTaqPCR循環(huán)過程50℃95℃2021/6/27872℃第2輪結束PCR循環(huán)過程2021/6/279模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增PCR循環(huán)過程第6輪擴增2021/6/2710PCR的反應動力學

PCR的三個反應步驟反復進行，使DNA擴增量呈指數(shù)上升。平均擴增效率的理論值為100%，但在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，靶序列DNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCR產物的逐漸積累，被擴增的DNA片段不再呈指數(shù)增加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯效應”，這種效應期稱平臺期。大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。

2021/6/2711

PCR擴增體系模板——

3’TTAGGCCTGGATAAGCGCCTGGA

5’引物——

5’ATCCGGACTaqDNA聚合酶dATPdGTPdCTPdTTPMg2+底物2021/6/2712PCR反應體系PCR反應五要素：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

標準的PCR反應體系：

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10～100pmol

模板DNA

0.1～2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+

1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

2021/6/2713引物引物是人工合成的兩段寡核苷酸單鏈，是PCR特異性反應的關鍵，擴增產物的大小也由特異引物限定。

3’

3’

2021/6/2714設計引物應遵循以下原則：

①引物長度：

15-30bp，常用為20-27bp左右。在做長片段PCR或做某些特殊的PCR時應使用較長的引物，但最多不超過50個核苷酸。②引物堿基：

G+C含量以40-60%為宜，過高或過低均不利于引發(fā)。ATGC最好隨機分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。

③避免引物自身互補，形成發(fā)夾結構，因空間位阻而影響其與模板結合。兩條引物間之間也不能互補，否則會形成引物二聚體，產生非特異的擴增條帶或降低引物有效濃度。

2021/6/2715④引物3’端的堿基，應嚴格要求配對，不可修飾，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗?？紤]到密碼子的簡并性，引物3′端不終止于密碼子第三個堿基。因該位置由于密碼子的簡并性影響擴增的特異性。引物的5‘端可以修飾，它對擴增特異性影響不大。如增加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等；引入點突變、啟動子序列等。⑤引物的特異性：

引物應該與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯的同源性，以減少引物與基因組的非特異性結合。2021/6/2716簡并引物

如果引物的序列是從基因產物蛋白質的氨基酸序列反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基差異。這樣的混合引物稱簡并引物。

簡并性(degeneracy)

遺傳密碼中，除色氨酸和蛋氨酸僅有一個密碼子外，其余氨基酸均有多個密碼子。2021/6/2717例如，

序列1：tgaatgcatgcatgc

序列2：tgcatgcatgcatgc

序列3：tgtatgcatgcatgc

若樣品并不能明確是1，2還是3，為了能從不確定序列來源的樣本中，擴增出同源序列來，你的引物實際上就是針對序列1，2，3設計的混合物。這樣不論是1，2還是3，采用你的引物均能有效擴增。

2021/6/2718套嵌引物設計多組引物，結合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產物的特異性。13242021/6/2719

引物的溶解與保存：①高濃度貯存分裝，避免反復凍融,臨用前稀釋②－20℃貯存

引物量：

每條引物的終濃度0.2～1umol，以最低引物量產生所需要的結果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增，且可增加引物之間形成二聚體的機會。2021/6/2720DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

①

熱穩(wěn)定性最大特點是熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合PCR過程的反復高溫變性要求。②

最適溫度高最適溫度：74-80oC(PCR延伸：72℃-）延伸速度：約35-150nt/s.酶分子最長延伸長度：6.7kb2021/6/2721③Taq酶的功能缺點具有5’

3’聚合酶活性和5’

3’外切酶活性，但沒有3‘

5’外切酶活性。因此不能修復錯誤的堿基配對！

合成超過600bp長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。

金屬離子敏感（尤其是Mg2+）。

2021/6/2722

1.不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異，由于酶的濃度對PCR反應影響極大，因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。

2.濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少.2021/6/2723底物：dNTP

1.dNTP小量分裝，-20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中，dNTP應為50～200umol/L，不能低于10～15μmol/L。濃度過高，與Mg2+結合，使游離的Mg2+濃度降低，抑制TaqDNA聚合酶的活性。濃度過低又會降低PCR產物的產量。尤其是注意4種dNTP的濃度要相等(等摩爾配制)，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時，就會引起錯配。降低合成速度，過早終止反應。

2021/6/2724模板(靶基因)要求：1.100

l反應體系中質粒DNA1-10ng，基因組DNA50-100ng足夠。2.純度要求不太嚴格，可以是粗品，但不能混有SDS、有機溶劑酚、氯仿等蛋白質變性劑以及任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白。2021/6/2725模板的種類：DNA或RNA。1.RNA：先通過反轉錄得到cDNA。2.質粒：線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實際操作中，往往不需要將質粒線性化，而直接用做模板。3.高分子量的脫氧核糖核酸（如基因組脫氧核糖核酸）做模板時，如果用適當?shù)拿赶冗M行消化再作為模板，擴增效果會更好。2021/6/2726Mg2+

Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響。Mg2+可以與dNTP結合，易化4種dNTP的協(xié)作，而且可以促進和穩(wěn)定引物-模板的相互作用。因此，Mg2+濃度過高，可出現(xiàn)非特異擴增。

濃度過低會降低TaqDNA聚合酶的活性，使反應產物減少。在一般的PCR反應中，各種dNTP濃度為200μmol/L時，Mg2+終濃度為1.5～2.0mmol/L為宜。

2021/6/2727PCR反應條件的選擇

基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。標準反應中采用三溫度點法對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸(此溫度TaqDNA酶仍有較高的催化活性)。

-----溫度與時間的設置2021/6/2728①變性溫度與時間：

變性溫度低，解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下，93℃～94℃1min足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。2021/6/2729②退火溫度與時間：退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度。

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

退火溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合。

退火時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結合。

2021/6/2730③延伸溫度與時間TaqDNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行

延伸溫度一般選擇在70～75℃之間，常用溫度為72℃。

反應時間，可據(jù)擴增片段的長度而定：

◆一般1Kb以內的DNA片段，延伸時間1min足夠。

◆

3～4kb的靶序列需3～4min；

◆10Kb需延伸至15min2021/6/2731④循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)影響PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般為25-30次，35次左右時，達到平臺期。循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產物的量亦隨之增多。

2021/6/2732PCR擴增產物分析

1.凝膠電泳分析：PCR產物電泳，EB染色,紫外儀下觀察.PCR產物片段的大小應與預計的一致。

①瓊脂糖凝膠電泳：通常應用1～2%的瓊脂糖凝膠，供檢測用。

②聚丙烯酰胺凝膠電泳：6～10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨率高，分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，而且DNA回收純度高。

2021/6/27332.酶切分析：根據(jù)PCR產物中限制性內切酶的位點，用相應的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進行產物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。3.分子雜交：如Southern印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈，標記后做探針，與PCR產物雜交。此法既可作特異性鑒定，還可知其分子量。4.斑點雜交：將PCR產物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于PCR產物特異性鑒定及變異分析。5.核酸序列分析：是檢測PCR產物特異性的最可靠方法。2021/6/2734★設定對照陽性陰性電泳樣品＋－S陽性陰性樣品＋＋＋－－－SSS①②③陽性對照:是PCR反應是否成功、產物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。2021/6/2735PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有:①模板的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性④PCR循環(huán)條件PCR產物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失

注意2021/6/27361、PCR常見問題：

出現(xiàn)非特異性擴增帶

無特異性擴增帶2、出現(xiàn)非特異性擴增帶可能原因酶量過多Mg2+濃度過高dNTP濃度過高引物濃度過高，引物設計特異性差模板純度差退火溫度過低循環(huán)次數(shù)過多陽性陰性電泳樣品＋－S2021/6/27373、無特異性擴增條帶可能原因陽性對照有擴增條帶，說明酶、底物、bf無問題，檢查模板與引物，一般是引物的問題?？赡芡嘶饻囟冗^高沒有加酶2021/6/2738片狀拖帶或涂抹帶

其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。對策：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④減少循環(huán)次數(shù)。

2021/6/2739假陰性

模板：①模板中含有Taq酶抑制劑.②提取制備模板時丟失過多，或吸入酚.③模板變性不徹底.對策：配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。（有時忘加Taq酶）.2021/6/27403.引物：引物的設計、質量、濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。

對策為：

①選定好的引物合成單位。

②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致。如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物降解失效。2021/6/2741假陰性

4.Mg2+濃度：濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量，甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。5.反應體積的改變：在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。6.物理原因：如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率.退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。7.靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。2021/6/2742假陽性

現(xiàn)象：①空白對照出現(xiàn)目的擴增產物。②出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，但其條帶更整齊，亮度更高引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而可能擴增出的PCR產物為非目的性的序列。引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。靶序列或擴增產物的交叉污染：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。二是空氣中的小片段核酸污染，可用巢式PCR方法來減輕或消除。2021/6/2743PCR污染的對策

實驗室分區(qū)設置PCR前試劑準備區(qū)

PCR前樣本處理區(qū)加樣區(qū)PCR擴增檢測區(qū)(一)合理分隔實驗室:

將樣品的處理、配制PCR反應液、PCR循環(huán)擴增及PCR產物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行，特別注意樣本處理及PCR產物的鑒定應與其它步驟嚴格分開。

實驗用品及吸樣槍應專用，實驗前應將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的脫氧核糖核酸或RNA。2021/6/2744(二)吸樣槍:由于操作時不慎將樣品或模板吸入槍內或粘上槍頭是一個嚴重的污染源，因而操作時要十分小心，吸樣要慢，吸樣時盡量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染(三)預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應小量分裝，另外，PCR試劑，PCR反應液應與樣品及PCR產物分開保存，不應放于同一冰盒或同一冰箱。(四)防止操作人員污染，使用一次性手套、吸頭、小離心管應一次性使用。(五)設立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ?，陽性對照以能出現(xiàn)擴增條帶的最低量的標準核酸為宜，并注意交叉污染的可能性，每次反應都應有一管不加模板的試劑對照及相應不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。(六)減少PCR循環(huán)次數(shù)，只要PCR產物達到基本要求水平就適可而止。(七)選擇質量好的Eppendorf管，以避免樣本外溢及外來核酸的進入，打開離心管前應先離心，將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕，以防管內液體濺出。

2021/6/2745Reversetranscription-polymerasechainreaction

反轉錄PCR

RT-PCR

2021/6/2746逆轉錄酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNAPCR擴增（一）定義：以mRNA為模板，反轉錄產生cDNA，再以cDNA為模板來擴增，即為反轉錄PCR。2021/6/2747反轉錄體系RNA模板——

3’UUAGGCCUGGAUAAGCGCCUGGA

5’引物——

5’ATCCGGAC反轉錄酶dATPdGTPdCTPdTTPMg2+

酶活性依賴金屬離子底物2021/6/2748（二）RT－PCR過程：1、反轉錄過程2、PCR過程3、結果分析2021/6/2749①提取總RNA（含mRNA，有條件可純化）②鑒定：完整性、純度、含量③體系：模板：總RNAormRNA，>1μg，純度1.8～