1.2發(fā)酵工程的無(wú)菌技術(shù)+第2課時(shí)+課件+高二下學(xué)期生物蘇教版選擇性必修3

第二節(jié)發(fā)酵工程的無(wú)菌技術(shù)第一章

發(fā)酵工程第2課時(shí)菌種是從事發(fā)酵工程實(shí)踐及微生物學(xué)等學(xué)科研究的基本材料和重要資源。因此，菌種的傳代和保存至關(guān)重要。菌種的傳代和保存要考慮菌種的生理、生化特性，盡量讓菌種在人工創(chuàng)造的條件下，降低細(xì)胞的代謝水平，使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài)，即微生物的生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡。低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物生長(zhǎng)和代謝的作用。因此低溫、干燥、真空是菌種保存的重要條件。厭氧微生物接觸氧氣會(huì)受到抑制、損傷甚至死亡，常采用穿刺接種的方法將其保護(hù)在培養(yǎng)基中。厭氧菌可在培養(yǎng)基深處的厭氧環(huán)境下生長(zhǎng)。斜面接種是常用的菌種傳代和低溫下保存菌種的方法。情境導(dǎo)入邊做邊學(xué)：斜面接種和培養(yǎng)酵母菌培養(yǎng)酵母菌準(zhǔn)備接種接種環(huán)滅菌試管口滅菌挑取少許菌體劃線接種斜面接種和培養(yǎng)酵母菌的操作步驟及其目的或分析說(shuō)明順序接種操作步驟目的或分析說(shuō)明①將接種環(huán)的環(huán)端和接種時(shí)可能進(jìn)入試管的部分放在酒精燈火焰上，來(lái)回灼燒多次將接種環(huán)滅菌，避免污染菌種②迅速將試管口通過(guò)火焰2～3次灼燒滅菌，防止試管口上的微生物污染培養(yǎng)基③將滅過(guò)菌的接種環(huán)伸入菌種管，先將環(huán)部接觸培養(yǎng)基斜面頂端或其他無(wú)菌體的培養(yǎng)基部位使接種環(huán)冷卻，避免殺死菌種邊做邊學(xué)：斜面接種和培養(yǎng)酵母菌斜面接種和培養(yǎng)酵母菌的操作步驟及其目的或分析說(shuō)明順序接種操作步驟目的或分析說(shuō)明④抽出接種環(huán)時(shí)，帶菌部位不要觸及管壁或通過(guò)火焰防止菌種沾于管壁；防止菌種被殺死⑤在培養(yǎng)基斜面上由底部向上輕輕劃“Z”型折線，但不要將培養(yǎng)基的表面劃破初步接種。劃破培養(yǎng)基不利于后續(xù)的繼續(xù)劃線，長(zhǎng)出的菌落不標(biāo)準(zhǔn)⑥將試管口與試管塞分別通過(guò)火焰2～3次，迅速塞緊試管防止雜菌污染⑦將接種過(guò)菌種的試管，放在恒溫箱(28℃)中培養(yǎng)24h培養(yǎng)酵母菌，觀察接種和培養(yǎng)的結(jié)果邊做邊學(xué)：斜面接種和培養(yǎng)酵母菌邊做邊學(xué)：斜面接種和培養(yǎng)酵母菌討論：1.培養(yǎng)24h后，能觀察到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是什么？如何將酵母菌培養(yǎng)在平板培養(yǎng)基上？2.在上述接種和培養(yǎng)過(guò)程中，我們注意到了哪些滅菌操作注意事項(xiàng)？微生物的菌種保存一般需要先挑選典型菌落，再接種在斜面培養(yǎng)基上，按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng)；待充分生長(zhǎng)后，將培養(yǎng)好的裝有新鮮菌種的試管用牛皮紙包扎好，置于4℃左右的冰箱中保藏，以減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā)，延長(zhǎng)保存時(shí)間。通常每隔2~3個(gè)月重新接種一次，再繼續(xù)保存。微生物分離、純化和培養(yǎng)的無(wú)菌技術(shù)平板劃線法是指把含有多種微生物的雜菌樣品，通過(guò)在特定的瓊脂平板表面劃線稀釋，從而獲得單個(gè)菌落的方法。連續(xù)劃線法分區(qū)劃線法通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落嘗試通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基能滿足酵母菌生長(zhǎng)、繁殖的營(yíng)養(yǎng)需要，利用前面實(shí)驗(yàn)中配制的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基制作平板。平板劃線法是實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行微生物分離和純化的常用方法之一。在制作好的酵母菌培養(yǎng)基平板上，采用無(wú)菌操作技術(shù)及平板劃線法能夠獲得純化的酵母菌菌落。實(shí)驗(yàn)器材和試劑酵母菌樣本（菌種），接種環(huán)，酒精燈，恒溫培養(yǎng)箱，高壓蒸汽滅菌鍋，馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基。通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落配制培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)步驟1.培養(yǎng)基和培養(yǎng)皿滅菌通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落滅菌：通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落實(shí)驗(yàn)步驟2.倒平板注意待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右時(shí)，在酒精燈火焰附近倒平板。①溫度：50℃左右②操作：在酒精燈火焰附近③冷凝后平板倒置防止瓶口微生物污染培養(yǎng)基防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染溫度過(guò)高容易燙傷，低于50℃瓊脂會(huì)凝固。避免雜菌污染。實(shí)驗(yàn)步驟3.劃線和培養(yǎng)參照?qǐng)D1-2-16，在平板上劃線，然后置于28℃恒溫培養(yǎng)箱。通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落①灼燒接種環(huán)，直至接種環(huán)金屬絲燒紅⑥將皿蓋打開(kāi)一條縫隙，將沾有菌種的接種環(huán)迅速伸入平板內(nèi)，劃3-5條平行線，蓋上皿蓋。⑤試管口通過(guò)火焰，并塞上棉塞②在火焰旁冷卻接種環(huán)，拔出酵母菌培養(yǎng)液試管的棉塞③試管口通過(guò)火焰④在火焰附近用接種環(huán)蘸取一環(huán)菌液⑦灼燒接種環(huán)，待其冷卻后，從第一次劃線的末端開(kāi)始作第二次劃線。重復(fù)以上操作，作第三、四、五次劃線。1.接種環(huán)只蘸一次菌液，但要在培養(yǎng)基不同位置連續(xù)劃線多次；2.劃線首尾不能相接；3.每次劃線前灼燒接種環(huán)進(jìn)行滅菌；4.劃線操作結(jié)束后，仍需灼燒接種環(huán)。接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌第3區(qū)劃線接種環(huán)滅菌接種環(huán)滅菌12345通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落完成平板劃線后，待菌液被培養(yǎng)基吸收，將接種后的平板和一個(gè)未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養(yǎng)溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24~48h。在實(shí)驗(yàn)室中，切不可吃東西、喝水，離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí)一定要洗手，以防止被微生物感染。使用后的培養(yǎng)基在丟棄前一定要進(jìn)行滅菌處理，以免污染環(huán)境。警示對(duì)照：說(shuō)明培養(yǎng)基是否被雜菌污染。通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落結(jié)果與分析培養(yǎng)24h后，若在劃線的末端出現(xiàn)不連續(xù)的單個(gè)菌落，表明酵母菌已經(jīng)被純化。如果酵母菌純化培養(yǎng)失敗，其原因很多。例如，接種環(huán)在取菌體前曾在酒精燈火焰上灼燒滅菌，此時(shí)接種環(huán)的溫度很高，若不冷卻就直接在斜面上挑取菌體，菌體可能因?yàn)榻佑|高溫接種環(huán)而死亡。此外，若第一次劃線前挑取的菌體過(guò)多，則也可能無(wú)法獲得由一個(gè)酵母菌形成的單個(gè)菌落。通過(guò)平板劃線法獲得純化的酵母菌菌落1mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL無(wú)菌水1×10稀釋涂布平板法分離和純化微生物稀釋涂布平板法也是常用的分離和純化微生物的方法。還可用于微生物計(jì)數(shù)。1.梯度稀釋菌液將涂布器放在火焰上灼燒，待酒精燃盡、涂布器冷卻后，再進(jìn)行涂布。用涂布器將菌液均勻地涂布在培養(yǎng)基表面。涂布時(shí)可轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使涂布均勻。將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中。取0.1mL菌液，滴加到培養(yǎng)基表面。移液槍待涂布的菌液被培養(yǎng)基吸收后，將平板倒置，放入30~37℃的恒溫箱培養(yǎng)1~2天。2.涂布平板

稀釋涂布平板法分離和純化微生物稀釋涂布平板操作后分離得到單菌落稀釋涂布平板法分離和純化微生物常用微生物分離方法比較比較平板劃線法稀釋涂布平板法工具接種環(huán)涂布器操作接種環(huán)在固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線系列梯度稀釋操作和涂布平板操作特點(diǎn)方法簡(jiǎn)單，但不適宜計(jì)數(shù)單菌落更易分開(kāi)，可以計(jì)數(shù)，但操作復(fù)雜，需涂布多個(gè)平板結(jié)果共同點(diǎn)都能將微生物分散到固體培養(yǎng)基表面，以獲得單細(xì)胞菌落，達(dá)到分離純化微生物的目的，也可用于觀察菌落特征稀釋涂布平板法分離和純化微生物有些微生物的分離和純化還可采用混合平板法，即將稀釋的少量菌懸液與50℃左右的培養(yǎng)基混合均勻后倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，再將培養(yǎng)皿置于合適溫度下培養(yǎng)，這樣在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部均可長(zhǎng)出單個(gè)菌落。有人說(shuō)，采用稀釋涂布平板法培養(yǎng)和計(jì)算得到的微生物的數(shù)量比稀釋液中實(shí)際微生物的數(shù)量要少。你同意這樣的觀點(diǎn)嗎？同意，稀釋涂布計(jì)數(shù)是根據(jù)微生物在平板表面上所形成的單個(gè)菌落來(lái)計(jì)數(shù)的，一個(gè)菌落代表一個(gè)單細(xì)胞。實(shí)際計(jì)數(shù)時(shí)，往往會(huì)出現(xiàn)菌落聚合在一起的情況，因?yàn)楫?dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)胞連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。因此，稀釋涂布平板法統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低。分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)1.學(xué)會(huì)配制選擇培養(yǎng)基，以分離出能分解尿素的細(xì)菌。2.學(xué)會(huì)采用稀釋涂布平板法分離和培養(yǎng)分解尿素的細(xì)菌，并進(jìn)行數(shù)。實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理在自然環(huán)境中，多種微生物常常生活在一起，要對(duì)其中的某種微生物進(jìn)行研究，就必須對(duì)其進(jìn)行分離和純化培養(yǎng)，以排除其他微生物的干擾。由于不同微生物對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分、氧、pH等的要求不同，通過(guò)提供要研究的微生物增殖生長(zhǎng)的必需條件，或加入某些抑制劑抑制其他微生物的增殖生長(zhǎng)，可分離和純化所需的微生物。在實(shí)驗(yàn)室中利用選擇培養(yǎng)基可以篩選和分離某種微生物，然后在高度稀釋的條件下，于固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)該微生物，形成單個(gè)菌落。單個(gè)菌落即為純化培養(yǎng)物，通過(guò)對(duì)菌落數(shù)量的統(tǒng)計(jì)，可以計(jì)算出樣品中的含菌數(shù)。分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)器材和試劑1.土壤樣品。2.滅菌處理過(guò)的移液管、試管、玻璃涂布器、錐形瓶、培養(yǎng)皿、燒杯，試管架、記號(hào)筆、天平、稱量紙、洗耳球、酒精燈。3.配制以尿素為氮源的1000mL選擇培養(yǎng)基的試劑，包括KH2PO41.4g、Na2HPO42.1g、MgSO4·7H2O0.2g、葡萄糖10.0g、尿素1.0g、瓊脂15.0g、蒸餾水1000mL、無(wú)菌水適量以及調(diào)節(jié)pH的相關(guān)試劑。分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)步驟1.選取土壤1×102.制備土壤懸液3.配制培養(yǎng)基及制作平板4.涂布分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)步驟4.涂布：從濃度最低的土壤懸液（質(zhì)量濃度為10-8g·L-1）開(kāi)始，先用無(wú)菌移液管吸取0.1L加入到標(biāo)記有10-8的培養(yǎng)皿中，再分別用無(wú)菌移液管從質(zhì)量濃度為10-7g·mL-1、10-6g·mL-1的土壤懸液中各吸取0.1mL加入到標(biāo)記有10-7、10-6的培養(yǎng)皿中，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，在平板上涂布均勻。分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)步驟5.培養(yǎng)與觀察：將已經(jīng)標(biāo)明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期以及樣品稀釋度的培養(yǎng)皿，倒置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)1~2d。每24h觀察一次每個(gè)培養(yǎng)皿中的細(xì)菌菌落。6.計(jì)數(shù)菌落：取出已培養(yǎng)1~2d的平板，統(tǒng)計(jì)每個(gè)培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。計(jì)算時(shí)，選取菌落數(shù)為30~300的一組為樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每克土壤樣品的細(xì)菌數(shù)=某一稀釋度幾次重復(fù)培養(yǎng)后的菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)：涂布所用稀釋液體積數(shù)。分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)M：代表稀釋倍數(shù)；C：代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)的平均菌落數(shù)；V：代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)4號(hào)試管的結(jié)果表明每克土壤中的活菌數(shù)約為_(kāi)_______個(gè)計(jì)算公式：每g樣品中的菌落數(shù)＝(C÷V)×M1.1×108分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)結(jié)果與分析菌落數(shù)目在30~300的一組平板上一般可以獲得單個(gè)分解尿素的細(xì)菌菌落。通過(guò)統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，可獲得每克土壤樣品中分解尿素的細(xì)菌數(shù)。知識(shí)拓展——菌種鑒定分離土壤中分解尿素的細(xì)菌并進(jìn)行計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中得到的菌落一定是分解尿素的細(xì)菌嗎？不一定，還需要進(jìn)一步的鑒定混合樣品得到的菌落不一定就是分解尿素的細(xì)菌，如自生固氮菌或利用（分解尿素的）細(xì)菌的代謝物進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖的微生物在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑。培養(yǎng)某種細(xì)菌后，如果PH升高，指示劑將變紅，說(shuō)明該細(xì)菌能夠分解尿素。原理：脲酶催化尿素分解成氨→培養(yǎng)基堿性增強(qiáng)→酚紅變紅酚紅培養(yǎng)基——鑒定分解尿素的細(xì)菌脲酶CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3知識(shí)拓展——菌種鑒定知識(shí)拓展——菌種鑒定鑒別培養(yǎng)基：在培養(yǎng)基中加入某種指示劑或化學(xué)藥品(不影響微生物正常生長(zhǎng))，使微生物的某種代謝產(chǎn)物與培養(yǎng)基中的特定指示劑或化學(xué)藥品發(fā)生反應(yīng)。從而達(dá)到鑒定目標(biāo)微生物的作用。伊紅-亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基鑒別大腸桿菌（若有，菌落呈深紫色，有金屬光澤）剛果紅培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌微生物的基本培養(yǎng)技術(shù)無(wú)菌技術(shù)煮沸消毒法純培養(yǎng)培養(yǎng)基固體培養(yǎng)基接種分離的方法平板劃線法稀釋涂布平板法種類液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分水、碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽消毒巴氏消毒法滅菌濕熱滅菌干熱滅菌灼燒滅菌化學(xué)消毒法紫外線消毒法根據(jù)物理性質(zhì)概念課堂小結(jié)隨堂訓(xùn)練1.下列有關(guān)用平板劃線法接種的操作，錯(cuò)誤的是A.將接種環(huán)放在火焰上灼燒B.用已冷卻的接種環(huán)挑取菌體C.用取菌體和劃線都要在火焰旁進(jìn)行D.接種環(huán)劃線要將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)的劃線相連√解析：劃線時(shí)，不能將最后一區(qū)的劃線與第一區(qū)的劃線相連，D錯(cuò)誤。2.下列有關(guān)微生物的分離與培養(yǎng)的敘述，錯(cuò)誤的是A.獲得純凈培養(yǎng)物的關(guān)鍵是防止雜菌污染B.倒置平板可防止培養(yǎng)皿蓋上的冷凝水滴落造成污染C.倒平板時(shí)將培養(yǎng)皿的蓋拿開(kāi)，以便于將錐形瓶中的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿D.檢驗(yàn)培養(yǎng)基是否被雜菌污染的最有效方法是將接種等體積無(wú)菌水的培

養(yǎng)基放在恒溫箱中培養(yǎng)√解析：倒平板時(shí)用食指和拇指將培養(yǎng)皿打開(kāi)一條稍大于錐形瓶瓶口的縫隙，使其恰好能讓錐形瓶瓶口伸入，隨后倒入培養(yǎng)