基因編輯Cas9系列講座1CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)及其基本應(yīng)用

?CRISPR-Cas9

基因編輯技術(shù)及其應(yīng)用解螺旋

|

知識(shí)金牌知識(shí)金牌解

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旋 | 陪

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醫(yī)

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長(zhǎng)Contents課程目錄第一部分第二部分下節(jié)課程基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展CRISPR/Cas9原理及其技術(shù)基本應(yīng)用dCas9相關(guān)應(yīng)用CRISPR-Cas9

基因編輯技術(shù)及其基本應(yīng)用基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展01知識(shí)金牌無(wú)模板：隨機(jī)修復(fù)（NHEJ）有模板：重組修復(fù)（HDR）Knock

out

Knock

inCRISPR-Cas9

基因編輯技術(shù)及其基本應(yīng)用解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌ZFN解

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長(zhǎng)TALEN第一部分

|基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展--ZFN與TALEN知識(shí)金牌來(lái)源于細(xì)菌和古細(xì)菌的免疫系統(tǒng)靶向切割外源入侵者的DNA解

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長(zhǎng)間隔序列第一部分

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基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展-CRISPR-Cas9起源知識(shí)金牌Cas9特點(diǎn)三要素：Cas9,crRNA,

tracrRNA識(shí)別模式：

RNA-DNA

；

識(shí)別長(zhǎng)度20

bp，

末端緊鄰PAM序列

(NGG)Cas9本質(zhì)上是RNA依賴(lài)的DNA內(nèi)切酶含有兩個(gè)切割結(jié)構(gòu)域，精確切割在PAM之前3bp處Cas9優(yōu)點(diǎn)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，簡(jiǎn)明的堿基互補(bǔ)設(shè)計(jì)原則識(shí)別不受基因組甲基化影響能靶向幾乎任意細(xì)胞任意基因方便同時(shí)靶向多個(gè)靶點(diǎn)切割效率高第一部分

|

基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展-CRISPR/Cas9解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9比較第一部分

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基因編輯技術(shù)的歷史與發(fā)展解

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長(zhǎng)CRISPR/Cas9技術(shù)原理應(yīng)用02知識(shí)金牌靶向DNA的基因編輯技術(shù)；sgRNA引導(dǎo)cas9蛋白到達(dá)指定靶點(diǎn)；Cas9蛋白切割DNA；遺傳物質(zhì)被破壞，但是生物體具有自我修復(fù)機(jī)制，隨著細(xì)胞復(fù)制分裂，努力修復(fù)切口；修復(fù)的過(guò)程，產(chǎn)生錯(cuò)配，移碼突變、缺失突變；篩選出錯(cuò)配純合子；基因組水平的基因編輯 第二部分

|

CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用--Cas9原理解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌RNAiCRISPR-CAS9作用水平mRNA水平基因組水平靶向范圍轉(zhuǎn)錄本外顯子、內(nèi)含子、啟動(dòng)子等所有基因組序列靶蛋白敲除水平部分敲除完全敲除靶蛋白功能部分喪失完全喪失基因表型的呈現(xiàn)度不一定呈現(xiàn)一定呈現(xiàn)同一基因多靶點(diǎn)表型一致率20±12%78±27%解

螺

旋|陪

伴

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成

長(zhǎng)參考文獻(xiàn)：

Science.

2014

Jan3;343(6166):84-7.

doi:10.1126/science.1247005Genome-scale

CRISPR-Cas9

knockout

screening

in

human

cells.第二部分

|

RNAi與CRISPR-Cas9在基因功能研究學(xué)中的比較知識(shí)金牌sgRNA比shRNA均一性高解

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長(zhǎng)第二部分

|

RNAi與CRISPR-Cas9在基因功能研究學(xué)中的比較Fig.1

Lentiviral

delivery

of

Cas9

and

sgRNAprovides

efficient

depletion

of

target

genes知識(shí)金牌普通編碼基因敲除篩選插入或缺失非3的倍數(shù)個(gè)堿基突變的純合子NHEJ（KNOCK-OUT）No.1解

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長(zhǎng)第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用知識(shí)金牌解

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成

長(zhǎng)第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用知識(shí)金牌參考文獻(xiàn)：Awuah

SG,

et

al.

Repair

shielding

of

platinum-DNA

lesions

in

testicular

germ

cell

tumors

byhigh-mobility

groupbox

protein

4imparts

cisplatin

hypersensitivity.

Proc

Natl

Acad

Sci

U

S

A.

2017

Jan

31;114(5):950-955.

28096358睪丸生殖細(xì)胞瘤對(duì)順鉑敏感性下降轉(zhuǎn)染6周Cas9基因敲除穩(wěn)轉(zhuǎn)株后，WB檢測(cè)結(jié)果第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用案例解

螺

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科

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成

長(zhǎng)知識(shí)金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用案例解

螺

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成

長(zhǎng)

NHEJ（KNOCK-OUT）應(yīng)用文章 Targeting

SAMHD1withthe

Vpx

protein

to

improve

cytarabinetherapy

for

hematological

malignancies.

Nature

Medicine.

2017RandomSplicingofSeveralExonsCausedbyaSingleBaseChangein

the

Target

Exon

of

CRISPR/Cas9

Mediated

Gene

Knockout.

Cell.

2016.BCL11A

enhancer

dissectionby

Cas9-mediated

in

situsaturatingmutagenesis.

Nature.

2016.Repair

shielding

of

platinum-DNA

lesions

in

testicular

germ

celltumors

by

high-mobility

group

boxprotein

4

imparts

cisplatin

hypersensitivity.

PNAS.

2016.IF:

30.357IF:

28.710IF:

38.138IF:

8.303知識(shí)金牌解

螺

旋 | 陪

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長(zhǎng)目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)病毒感染預(yù)實(shí)驗(yàn)確定MOI感染過(guò)病毒的細(xì)胞單克隆生長(zhǎng)，確定細(xì)胞增值Puro濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)Blast濃度預(yù)實(shí)驗(yàn)按照MOI感染LentiCas9-

Blast感染72HBlasticidin篩選48H換液Blasticidin篩選48HCell-Cas9穩(wěn)轉(zhuǎn)株半藥維持RT確定Cas9表達(dá)按MOI感染目的gRNA感染72HPuro篩選48H換液Puro篩選48HCell-Cas9-gRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)株

半藥維持繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞充分切割一周提取DNA，PCR出gRNA位點(diǎn)上下游約200bp測(cè)試PCR引物PCR產(chǎn)物送測(cè)根據(jù)測(cè)序峰圖雜峰情況，選出最優(yōu)靶點(diǎn)細(xì)胞分單克隆需要30個(gè)以上單克隆單克隆生長(zhǎng)選擇10個(gè)提DNA，PCR送出選擇測(cè)序峰圖為雙峰的DNA，TA

克隆，送測(cè)8個(gè)斑根據(jù)TA克隆結(jié)

果，找到雙切純合子是否雙切純合子擴(kuò)大培養(yǎng)，即為所得目的細(xì)胞

有無(wú)選擇10個(gè)單克隆提DNA送測(cè)繼續(xù)上述過(guò)程，直到找到純合子gRNA載體構(gòu)建+病毒包裝第二部分

|

CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-慢病毒Cas9應(yīng)用知識(shí)金牌適用于lncRNA，miRNA，啟動(dòng)子，內(nèi)含子,編碼序列等；大片段刪除No.2第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用原序列切除克隆示意圖gRNA1gRNA2······解

螺

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長(zhǎng)知識(shí)金牌參考文獻(xiàn)：LuR,etal.EpigeneticPerturbationsbyArg882-MutatedDNMT3APotentiateAberrantStemCellGene-ExpressionProgramandAcute

Leukemia

Development.

CancerCell.

2016

Jul

11;30(1):92-107.27344947CovarrubiasS,etal.CRISPR/Cas9-basedscreeningoflongnoncoding

RNAs(lncRNAs)inmacrophageswithanNF-kappaBreporter.JBiolChem.

2017

Oct19.29051223解

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伴

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成

長(zhǎng)第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用案例知識(shí)金牌參考文獻(xiàn)：YangS,etal.CRISPR/Cas9-mediatedgeneeditingamelioratesneurotoxicityinmouse

model

of

Huntington‘s

disease.

J

Clin

Invest.

2017

Jun

30;127(7):2719-2724.

28763160解

螺

旋|陪

伴

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科

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成

長(zhǎng)第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用案例知識(shí)金牌

大片段刪除應(yīng)用文章 解

螺

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科

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成

長(zhǎng)mTORC1

and

muscle

regeneration

are

regulated

by

the

LINC00961-

encodedSPAR

polypeptide.

Nature.

2016.Epigenetic

Perturbationsby

Arg882-MutatedDNMT3A

PotentiateAberrantStemCellGene-ExpressionProgramandAcuteLeukemiaDevelopment.

Cancer

Cell.

2016.Challenges

of

CRISPR/Cas9

applications

for

long

non-coding

RNAgenes.

Nucleic

Acids

Researc.

2016.EffectiveknockdownofDrosophilalongnon-codingRNAsbyCRISPRinterference.

Nucleic

Acids

Research.

2016.Targeting

non-coding

RNAs

with

the

CRISPR/Cas9

system

in

humancell

lines.

Nucleic

Acids

Research.

2016.IF:

38.138IF:

23.214IF:

9.202IF:

9.202IF:

9.202第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用知識(shí)金牌293，Hela細(xì)胞適用同源定向修復(fù)（homology-directed

repair,HDR）；精確插入堿基。KNOCK-INNo.3第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌

KNOCK-IN文章分析 雙切割HDR

Donor顯著提高CRISPR介導(dǎo)的DSB后293T細(xì)胞的HDR效率解

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成

長(zhǎng)參考文獻(xiàn)：ZhangJP,etal.Efficientpreciseknockinwithadouble

cut

HDR

donor

afterCRISPR/Cas9-mediated

double-stranded

DNA

cleavage.

Genomebiology(2017)

20;18(1):35.

28219395第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用知識(shí)金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用PRDM14基因位點(diǎn)敲入解

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長(zhǎng)知識(shí)金牌第二部分

|CRISPR/Cas9技術(shù)應(yīng)用-Cas9應(yīng)用Puro篩選后，細(xì)胞大量死亡解

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