(高清版)DB43∕T 956-2014 南方水稻黑條矮縮病毒檢測方法R∕T-PCR法

南方水稻黑條矮縮病毒檢測方法2014-10-21發(fā)布2014-11-20實施I前言 Ⅱ1范圍 1 13術(shù)語和定義 14縮略語 25.1試劑 25.2儀器設(shè)備 25.3操作程序 26檢測后樣品的處理 4附錄A(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑配制 5附錄B(資料性附錄)南方水稻黑條矮縮病毒侵染水稻典型癥狀 附錄C(規(guī)范性附錄)RT-PCR電泳圖 7ⅡDB43/T956—2014本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識別這些專利的責(zé)任。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所提出。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由湖南省植物保護(hù)研究所起草。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：張松柏、劉勇、張德詠、羅香文、彭靜。1本規(guī)程規(guī)定了南方水稻黑條矮縮病毒檢測方法RT-PCR法的術(shù)語和定義、RT-PCR檢測方定、檢測后樣品處理等技術(shù)要求。本規(guī)程適用于侵染水稻的南方水稻黑條矮縮病毒下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB6682-2008分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法。3術(shù)語和定義反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)ReverseTranscriptasePolymeraseChainReaction,RT-PCR是結(jié)合RNA反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(PCR)的檢測技術(shù)。先以總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄酶的作用合成cDNA,然后以cDNA為模板，利用特異性引物擴(kuò)增得到目的片段。4縮略語bp:堿基對dNTPs:脫氧核糖核苷三磷酸RT-PCR:反轉(zhuǎn)錄PCRDEPC:焦碳酸二乙酯25.1試劑5.1.51.5%瓊脂糖凝膠：見附錄A.2。5.1.650×TAE緩沖液：見附錄A.3。5.1.7SYBRGreenI染色液(100×)5.2.4超低溫冰箱(-80℃)。5.3操作程序溫放置(5～10)min;5.3.2.2加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15sec,室溫放置3min;12000rpm4℃離心10min。35.3.2.5沉淀用1mL75%乙醇洗滌2次；12000rpm4℃離心3min,棄上清，室溫干燥(5~10)min。5.3.2.6加入(30~50)μLDEPC處理ddH?O,充分溶解，置于-80℃保存，或用于RT-PCR檢測?？俁NA提取液RT溶液(5×)隨機(jī)六聚體引物(0.1μg/H1)dNTP溶液(2.5mM/each)RNA酶抑制劑(50U/H1)反轉(zhuǎn)錄酶(5U/μl)DEPC處理ddH?O取一干凈離心管(DEPC水處理),按表1依次加入檢測試劑，42℃孵育30min,85℃加熱5mincDNA合成第一鏈產(chǎn)物PCR緩沖液(10×)Taq酶(5U/HL)滅菌ddH?O45.3.3.4PCR擴(kuò)增35個循環(huán)：94℃30sec,52℃30sec,72℃1min;最后，72℃10min;4℃保存。1.5%瓊脂糖凝膠的點樣孔內(nèi)，同時設(shè)置DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA作為片段大小標(biāo)準(zhǔn)，80V電壓電泳約30min。5.3.4.2成像及分析將電泳后的瓊脂糖凝膠放置于凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)，打開紫外燈，在凝膠成像系統(tǒng)控制軟件上觀察PCR擴(kuò)增條帶。5.3.5結(jié)果判定在凝膠成像系統(tǒng)觀察，電泳后的瓊脂糖凝膠上，陽性對照出現(xiàn)一條1087bp大小的特異性條帶，陰性對照沒有該特異性條帶。供試樣品出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性條帶，判定為陽性，即該樣品帶南方水稻黑條矮縮病毒；供試樣品沒有出現(xiàn)與陽性對照大小一致的特異性條帶，判定為陰性，即該樣品不帶南方水稻黑條矮縮病毒(電泳圖參見附錄C)。6檢測后樣品的處理樣品應(yīng)保存于-80℃冰箱或集中銷毀，用具應(yīng)進(jìn)行滅活處理。5附錄A(規(guī)范性附錄)相關(guān)試劑的配制A.1變性液將250g異硫氰酸胍、17.6mL0.75molL(pH7.0)檸檬酸鈉和26.4mL10%(m/V)十二烷基肌酸鈉溶293mL水中。65℃條件下攪拌、混勻，直至完全溶解。室溫條件下可保存3個月，每次使用前按每50mL變性液加入0.35mL的14.4mol/L的β-巰基乙醇。變性液可在室溫下避光保存1個月。用瓊脂糖1.5g,0.5×TAE電泳緩沖液100mL,混勻后在微波爐中完全融化，待冷至50~60℃時，搖勻倒入電泳板上，凝固后取下梳子，備用。242gTris堿、57.1mL冰醋酸、37.2gNa?EDTA2H2O,加A.4上樣緩沖液(5×)TrisCl(pH8.0),在800mLddH?O中溶解121gTris堿，用濃HCI調(diào)節(jié)pH至8.0。DEPC100L,加超純水至100mL,室溫過夜，121℃高壓15min,分裝到1.5mLDEPC處理過A.6DEPC水75%乙醇用75mL無水乙醇，加DEPC水至100mL,混勻，4℃保存?zhèn)溆?。正向引物?'>AGAGAATGGCAGACCTAGAGCG<3'反向引物：5'>TACAATGAAATTGACCAAGAAG<3'引物合成后凍存于-20℃。待用時應(yīng)稀釋至10μmolL濃度。擴(kuò)增時2條引物在同一體系中，擴(kuò)增結(jié)束后出現(xiàn)大小為1087bp的目的片段。6附錄B(資料性附錄)秧苗期感病的稻株，嚴(yán)重矮縮(不及正常株高1/3),不能拔節(jié)；本田初期感病的稻株，明顯矮縮 (約為正常株高1/2),不抽穗或僅抽包頸穗；分蘗期和拔節(jié)期感病稻株，矮縮不明顯，能抽穗，但穗小、不實粒多、粒重輕；發(fā)病稻株葉色深綠，上部葉的葉面可見凹凸不平的皺褶，皺褶多發(fā)生于葉片近基部；拔節(jié)期的病株，地上數(shù)節(jié)節(jié)部有氣生須根及高節(jié)位分枝；病株莖稈表面有乳白色大小約1-2mm的瘤狀突起(手摸有明顯粗糙感),瘤突呈蠟點狀縱向排列成一短條形，早期乳白色，后期褐黑色；病瘤產(chǎn)生的節(jié)