第14章基因重組和基因工程課件

2010-第14章基因重組和基因工程

基因重組和基因工程第14章2010-第14章基因重組和基因工程

二、重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)一、自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移內(nèi)容2010-第14章基因重組和基因工程DNA重組接合作用(conjugation)轉(zhuǎn)化作用(transformation)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用

(transduction)轉(zhuǎn)座

(transposition)同源重組

(homologousrecombination)2010-第14章基因重組和基因工程發(fā)生在同源序列間的重組稱為同源重組(homologousrecombination)，又稱基本重組（generalrecombination）。一、同源重組

內(nèi)切酶

(recBCD)DNA侵?jǐn)_(recA)分支遷移

(recA)

內(nèi)切酶(recBCD)

DNA

連接酶5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′5′3′3′3′5′3′5′3′3′5′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′Holiday中間體5′3′5′3′5′3′5′3′5′5′3′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′5′5′5′5′3′3′3′3′內(nèi)切酶(ruvC)內(nèi)切酶(ruvC)DNA連接酶DNA連接酶片段重組體拼接重組體2010-第14章基因重組和基因工程二、細(xì)菌的基因轉(zhuǎn)移與重組（一）接合（conjugation）質(zhì)粒2010-第14章基因重組和基因工程（二）轉(zhuǎn)化（transformation)2010-第14章基因重組和基因工程（三）轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)2010-第14章基因重組和基因工程插入序列（IS因子）特征：很小的DNA片段末端具有倒置重復(fù)序列10三、DNA的轉(zhuǎn)座2010-第14章基因重組和基因工程轉(zhuǎn)座作用的機(jī)制限制性內(nèi)切酶切開靶序列轉(zhuǎn)座子插入，形成具有單鏈粘性末端的轉(zhuǎn)座子修補(bǔ)缺刻，形成直接重復(fù)序列。2010-第14章基因重組和基因工程分為復(fù)制型和非復(fù)制型兩大類復(fù)制型非復(fù)制型2010-第14章基因重組和基因工程遺傳效應(yīng)引起插入突變，可導(dǎo)致基因表達(dá)失活。產(chǎn)生新的基因。產(chǎn)生的染色體畸變，引起DNA缺失或倒位。引起的生物進(jìn)化，可產(chǎn)生新的生物學(xué)功能的基因。2010-第14章基因重組和基因工程

二、重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)一、自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移內(nèi)容2010-第14章基因重組和基因工程

限制性核酸內(nèi)切酶逆轉(zhuǎn)錄酶

T4DNA連接酶常用的工具酶2010-第14章基因重組和基因工程限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點(diǎn)或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。BamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+2010-第14章基因重組和基因工程2010-第14章基因重組和基因工程HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’3’目錄DNA連接酶(DNAligase)2010-第14章基因重組和基因工程二、重組DNA技術(shù)基本原理2010-第14章基因重組和基因工程基因克隆過程示意圖

以質(zhì)粒為載體的DNA

克隆過程2010-第14章基因重組和基因工程（一）目的基因的獲取化學(xué)合成法基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)cDNA文庫(cDNAlibrary)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)限制酶切位點(diǎn)限制酶消化除去中間片段cosLRcoscosL左臂Rcos右臂真核生物染色體DNA限制酶部分消化外源DNA與載體DNA混合連接反應(yīng)體外包裝用重組噬菌體感染大腸桿菌~20KbDNA片段cosLRcos~20Kb外源DNA片段基因文庫基因組文庫2010-第14章基因重組和基因工程cDNA文庫構(gòu)建:用噬菌體載體2010-第14章基因重組和基因工程2010-第14章基因重組和基因工程克隆載體(cloningvector)擴(kuò)增DNA表達(dá)載體(expressionvector)讓DNA表達(dá)成蛋白質(zhì)（二）載體的選擇和構(gòu)建2010-第14章基因重組和基因工程載體的要求能自主復(fù)制；具標(biāo)記，便于篩選；有多個(gè)單一酶切位點(diǎn)有一定的容量2010-第14章基因重組和基因工程質(zhì)粒

(plasmid)2010-第14章基因重組和基因工程

PolylinkerMCS:multiplecloningsitePromega2010-第14章基因重組和基因工程Invitrogen真核表達(dá)載體示例2010-第14章基因重組和基因工程噬菌體載體2010-第14章基因重組和基因工程粘性質(zhì)粒(cosmid)酵母人工染色體

(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體

(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連（三）基因與載體連接單酶切克隆2010-第14章基因重組和基因工程雙酶切克隆目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶連接重組體載體自連目的基因自連平端連接

2010-第14章基因重組和基因工程質(zhì)粒DNA：制備感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)入（四）重組DNA轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞噬菌體DNA：包裝后吸附感染細(xì)菌病毒載體：包裝后感染受體細(xì)胞2010-第14章基因重組和基因工程抗藥性標(biāo)志補(bǔ)救(markerrescue)原位雜交免疫方法（五）重組體的篩選α互補(bǔ)利用α互補(bǔ)原理篩選重組體pUC18

原位雜交雞的β肌球蛋白的克隆和檢出免疫學(xué)方法2010-第14章基因重組和基因工程（六）克隆基因的表達(dá)原核表達(dá)體系（細(xì)菌）：優(yōu)點(diǎn)：培養(yǎng)方法簡單，迅速、經(jīng)濟(jì)又適合大規(guī)模生產(chǎn)工藝，經(jīng)驗(yàn)豐富不足：只用于表達(dá)cDNA不能進(jìn)行翻譯后修飾易形成不溶性包涵體2010-第14章基因重組和基因工程真核表達(dá)體系（酵母，昆蟲細(xì)胞，哺乳細(xì)胞等）：優(yōu)點(diǎn)：可進(jìn)行適當(dāng)?shù)男揎?，蛋白可分布于胞?nèi)一定區(qū)域并積累不足：操作麻煩，費(fèi)時(shí)，不經(jīng)濟(jì)2010-第14章基因重組和基因工程基因重組總結(jié)2010-第14章基因重組和基因工程

二、重組DNA技術(shù)三、重組DNA技術(shù)與醫(yī)學(xué)一、自然界DNA重組和基因轉(zhuǎn)移內(nèi)容2010-第14章基因重組和基因工程一、疾病基因的發(fā)現(xiàn)與克隆家族性耳聾鼻咽癌2010-第14章基因重組和基因工程生物制藥2010-第14章基因重組和基因工程生物藥物現(xiàn)狀與展望

截止到2004年2月,美國FDA批準(zhǔn)的生物技術(shù)藥物共79種。

2005年底，美國共有1415家生物技術(shù)公司，其中329家是上市公司。全部上市公司2005年底的總市值超過4100億美元。

2000年，在全球十大暢銷藥物中，生物技術(shù)藥物只有安進(jìn)的Epogen和強(qiáng)生的Procrit（epoetinalfa）。

2008年的十大暢銷藥物中，有5只生物技術(shù)產(chǎn)品（Avastin，Enbrel，Epogen/Procrit，Remicade和Rituxan）名列其中。

2014年，在前100只暢銷藥物中，生物技術(shù)藥物所占比例將超過50%，而在2000年和2008年時(shí)分別僅為11%和28%。2010-第14章基因重組和基因工程發(fā)展生物制藥的領(lǐng)域：1激素類：

胰島素，生長激素2細(xì)胞因子：干擾素、集落刺激因子、白細(xì)胞介素、腫瘤壞死因子、趨化因子、轉(zhuǎn)化生長因子、生長因子、促紅細(xì)胞生成素（EPO)等。3溶血栓藥物：纖溶酶原、鏈激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等2010-第14章基因重組和基因工程4血液代用品：

定型紅細(xì)胞、萬能型紅細(xì)胞、重組血紅蛋白5基因工程抗體：治療腫瘤、抗移植反應(yīng)、抗病毒、抗過敏6重組可溶性受體：纖溶酶原、鏈激酶、尿激酶、葡激酶、水蛭素等2010-第14章基因重組和基因工程7病毒疫苗（亞單位疫苗和DNA疫苗）：HIV、乙肝、丙肝、戊肝、EBV，單純皰疹病毒、巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、登革熱病毒、埃博拉病毒、SARS8細(xì)菌疫苗：

9寄生蟲疫苗：2010-第14章基因重組和基因工程基因診斷(geneticdiagnosis)：在DNA水平分析、鑒定遺傳疾病所涉及基因的置換、缺失或插入等突變。三、基因診斷與治療2010-第14章基因重組和基因工程基本過程：區(qū)分或鑒定DNA的異常分離、擴(kuò)增待測的DNA片斷2010-第14章基因重組和基因工程（二）基因治療的概念定義基因治療(genetherapy)是向有功能缺陷的細(xì)胞補(bǔ)充相應(yīng)功能的基因，以糾正或補(bǔ)償其基因的缺陷，從而達(dá)到治療的目的。2010-第14章基因重組和基因工程1.產(chǎn)前診斷2.攜帶者測試3.癥候前診斷4.遺傳病易感性四、遺傳疾