(高清版)DB41∕T 1590-2018 飼料中阪崎腸桿菌的檢測(cè) EMA-PCR法

DB41DB41/T1590—2018飼料中阪崎腸桿菌的檢測(cè)EMA-PCR法2018-04-17發(fā)布2018-07-17實(shí)施河南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布I1GB4789.40食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)克羅諾桿菌屬）：a）上游引物：5＇-CTGCTCTGCTGACGAGTGG-3';2培養(yǎng)24h±2h。如果試樣量不足25g，試樣質(zhì)量與增菌液的體積比應(yīng)為1∶9。上，鹵素?zé)粽丈湎缕毓?min，然后水浴煮沸10min，再將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中使其快速冷卻。渦旋混勻稱(chēng)取1.2g瓊脂糖（4.6）加入100mL1×TAE電泳緩沖液（4.9）中，加熱使其充分熔化，冷至65℃左右，加入5μL溴化乙錠（4.12），充分混勻，根據(jù)需要在模板內(nèi)放入合適的梳子，倒入凝膠3與1μL6×上樣緩沖液（4.10）混合后加入到上樣孔內(nèi)，取Mar恒壓下電泳20min～30min。如果阪崎腸桿菌陽(yáng)性對(duì)照的PCR產(chǎn)物在932bp處出現(xiàn)條帶（參見(jiàn)附錄B同時(shí)陰性對(duì)照PCR產(chǎn)物于932bp處未出現(xiàn)條帶，則檢測(cè)結(jié)果成立；否則樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在932bp處出現(xiàn)條帶，則為疑似陽(yáng)性樣品，此時(shí)需按GB4789.40進(jìn)行確證，樣品的PCR產(chǎn)物電泳后在932bp處未出現(xiàn)條帶，判定25g樣品中未檢出阪崎腸桿菌。4培養(yǎng)基和試劑A.1.1成分10.0g5.0g1.5g9.0g水1000mLA.1.2制法A.2改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬(wàn)A.2.1改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（mLSTA.2.1.1成分34.0g20.0g5.0g2.75g2.75g0.1g水1000mLA.2.1.2制法加熱攪拌至溶解，調(diào)節(jié)至pH6.8±0.2。分裝每管10mL，121℃高壓滅菌15min。A.2.2萬(wàn)古霉素溶液A.2.2.1成分萬(wàn)古霉素10.0mgA.2.2.2制法10.0mg萬(wàn)古霉素溶解于10.0mL水中，過(guò)濾除菌。萬(wàn)古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。5A.2.3改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-A.3.1成分242.0g37.2g57.1mL942.9mLA.3.2制法調(diào)節(jié)至pH8.3，定容至1L后，室溫保存。使用時(shí)稀釋50倍即為A.4.1成分0.5g0.5g0.5mol/L乙二胺四乙酸（EDTA，pH8.0）0.06mL360mL640mLA.4.2制法0.5mol/LEDTA（pH8.0）溶于500mL滅菌水中，加入溴酚藍(lán)和二甲苯氰FF溶解，與甘油混合，定容至1000mL，分裝后4℃保存。A.5.1成分疊氮溴化乙錠5mg滅菌水25.0mLA.5.2制法5mg疊氮溴化乙錠溶于5mL滅菌水中，定容至25mL，充分混勻，分裝后-20℃避光保存。6(資料性附錄)阪崎腸桿菌活菌EMA-PCR擴(kuò)增電泳圖