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文檔簡介

益生菌劑胃液耐受性檢驗(yàn)方法Inspectionmethodsforresistancetogastricjuiceofprobioticsculturespreparations2024-01-22發(fā)布2024-03-01實(shí)施中國營養(yǎng)保健食品協(xié)會發(fā)布I國食品發(fā)酵工業(yè)研究院、內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)(集團(tuán))股份有限公司、中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研中心、南昌大學(xué)食品科學(xué)與資源挖掘全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室貿(mào)易有限公司、恒天然商貿(mào)(上海)有限公司、河北一然生物科技股份有限公司、通標(biāo)有限公司、Life-SpaceGroupP穎、楊潞芳、楊玲、陳軍、古哈爾尼沙·格熱提、毛躍建、陳玉新、李良、尚可、郭晶、張曉娜1本文件適用于粉末狀和顆粒狀益生菌劑的胃液耐受性2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成文本必不可少的條件,僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和益生菌劑probioticsculturespreparat一種或多種活性益生菌,經(jīng)發(fā)酵、富集、乳化或不益生菌劑在胃部環(huán)境中耐受胃液的程度,以益生菌經(jīng)胃液處理后的活菌總4設(shè)備和材料24.3渦旋混合器。4.4恒溫水浴鍋:50℃±2℃。4.5拍擊式均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋。4.6恒溫培養(yǎng)箱:37℃±2℃。4.9微量移液器及無菌吸頭:1mL、5mL。4.10無菌注射器。4.11針頭過濾器:0.22μM。5培養(yǎng)基和試劑本方法中所用的水,在未注明其他要求時(shí),應(yīng)符合GB/T6682中三級水的規(guī)格,所明其他規(guī)格時(shí),均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液,雜質(zhì)測):5.6氯化鈉:CAS7647-14-移取8.3mL濃鹽酸溶于80mL水中,再加水3稱取氯化鉀0.064g、磷酸二氫鉀0.015g、碳酸氫鈉0.263g、氯化鈉0.345g、六水合氯化鎂0g、碳酸銨0.006g、1.5g胰蛋白胨、0.05gL-半胱氨酸鹽酸濃鹽酸(5.2)或1mol/L氫氧化鈉溶液(6.1)調(diào)節(jié)pH至3.0,定容至100mL,121℃高壓滅菌1稱取二水合氯化鈣0.022g,加水溶解并定容至100mL,121℃高壓滅菌15min。稱取氯化鈉8.5g,L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物0.5g,加入1000mL蒸餾水充分溶解,分裝后121℃高壓滅菌15min。4根據(jù)益生菌劑樣品特點(diǎn)和試驗(yàn)?zāi)康?,可選擇不同模擬胃液條件開展益生菌劑胃液耐受性8.2.2.3按附錄B測定樣品菌液(8.2.2.2)活菌總數(shù),記為N1。8.2.2.5根據(jù)8.2.2.1步驟選擇的模擬胃液條件8.2.2.6重復(fù)步驟8.2.2.1-8.2.2.5完成兩次胃液耐受為N2和N3,8.2.2.5步驟中活菌總數(shù)測定結(jié)果記為N2’和A=(++)××100%……………A——胃酸耐受性,用百分率(%)表示;N1——第一次胃液耐受性檢驗(yàn)初始活菌總數(shù),單位為CFU/mL;N2——第二次胃液耐受性檢驗(yàn)初始活菌總數(shù),單位為CFU/mL;N3——第三次胃液耐受性檢驗(yàn)初始活菌總數(shù),單位為CFU/mL;59.1應(yīng)根據(jù)模擬胃液實(shí)驗(yàn)條件,報(bào)告益生菌胃液耐受性,結(jié)果以保留整數(shù)形式表示,報(bào)告單位為9.2若胃液耐受性檢驗(yàn)的模擬胃液pH值為3.0,應(yīng)報(bào)9.3若胃液耐受性檢驗(yàn)的模擬胃液pH值為2.0,應(yīng)報(bào)告“空腹胃9.4若胃液耐受性檢驗(yàn)的模擬胃液pH值為4.0,應(yīng)報(bào)告“飽腹胃液6A.1一般規(guī)定本方法中所用的水,在未注明其他要求時(shí),應(yīng)符合GB/T6682-2008中水的規(guī)格。所注明其他規(guī)格時(shí),均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑A.2術(shù)語和定義在37℃和pH2.0條件下,胃蛋白酶水解血紅蛋白產(chǎn)生可溶性酪氨酸肽,在280nm吸光度A.3設(shè)備和材料A.3.1.天平:感量0.01g。A.3.2.pH計(jì):精確度0.1,每次使用前需按照儀A.3.3.恒溫水浴鍋37±1)℃。A.4試劑A.5溶液配制A.5.1.2%血紅蛋白溶液稱取0.2g血紅蛋白(A.4.1),加水溶解并定容至10mL,用1mol/L氫氧化鈉溶液(6.1)或1mol/LA.5.2.5%三氯乙酸溶液稱取5.0g三氯乙酸(A.4.2加水溶解并定容至100mL。7移取0.1mL1M鹽酸溶液(6.2加水定容至100mL。A.6檢驗(yàn)方法A.6.1.原理用分光光度計(jì)于波長280nm處測定溶液的吸光度。酶活力與吸光度成正比,由此可以A.6.2.樣品測定A.6.2.1.胃蛋白酶溶液的制備稱取0.1g胃蛋白酶,0.12g三羥甲基氨基甲烷,0.88g氯化鈉,加入80mL蒸餾水充分mol/L氫氧化鈉溶液(6.1)或1mol/L鹽酸溶液(6.2)調(diào)節(jié)pHmM鹽酸溶液(A.5.3)將胃蛋白酶稀釋至2A.6.2.2.樣品測定渦旋30s,再加入500μL2%血紅蛋白溶液(),A.6.2.2.2.量取500μL2%血紅蛋白溶液(A.5.1)和100μL胃蛋白酶溶液(A.6.2.1)于2mL離心管中混合,37℃水浴10min,加入1mL5%三氯乙酸溶液(A.5.2)渦旋30sA.6.2.2.3.將A.6.2.2.1和A.6.2.2.2的離心管于6000×g離心30min。A.6.2.2.4.在280nm波長處,用l0mm比色皿測定A.6.2.2.1的空白吸光度A0和A.6.2.2.2的吸光度A1。A.6.2.3.計(jì)算X1——胃蛋白酶的酶活力,單位為酶活力單位每毫克(U/mgA0——溶液的空白吸光度;A1——胃蛋白酶溶液的吸光度;X——最終反應(yīng)混合物中胃蛋白酶的濃度(mg/mL8本方法中所用的水,在未注明其他要求時(shí),應(yīng)符合GB/T6682-2008中水的規(guī)格。所注明其他規(guī)格時(shí),均指分析純。分析中所用標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液、雜質(zhì)測定用標(biāo)準(zhǔn)溶液、制劑B.3.1.磷酸緩沖鹽溶液(PBS緩沖液):稱取氯化鈉8.mol/L鹽酸溶液(6.2)調(diào)節(jié)pH至6.2±09根據(jù)樣品活菌總數(shù)范圍,選擇合適的稀釋度試管,分別吸取1.0mL樣品勻液于無菌稀釋度做兩個(gè)無菌平皿;同時(shí)分別吸取1.0mL磷酸緩沖鹽溶液(B.3.1)和1.0mL稀釋液(B.3菌平皿內(nèi)作空白對照。將約15mL冷卻至50℃的MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注至無菌平皿中,順時(shí)針或轉(zhuǎn)動無菌平皿至少20次使其混合均勻,待瓊脂菌落無生長或生長較小可選擇培養(yǎng)至72h,培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。從樣品稀釋到平根據(jù)樣品活菌總數(shù)范圍,選擇合適的稀釋度試管,分別吸取1.0mL樣品勻液于無菌稀釋度做兩個(gè)無菌平皿;同時(shí)分別吸取1.0mL磷酸緩沖鹽溶液(B.3.1)和1.0mL稀釋液(B.3.2)于無菌平皿內(nèi)作空白對照。將約15mL冷卻至50℃的TOS丙酸鹽瓊脂培養(yǎng)基傾注至無菌平皿中,順時(shí)針或逆時(shí)針轉(zhuǎn)動無菌平皿至少20次使其混合均勻,待瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),37℃±2℃厭氧培養(yǎng)48h±2h。若菌落無生長或生長

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