高等植物厭氧適應的生理及分子機制課件

植物學專題討論

高等植物厭氧適應的生理及分子機制高等植物厭氧適應的生理及分子機制氧是細胞線粒體膜上電子傳遞的最終受體，驅動能量梭子ATP合成，構成整個植物生命體代謝的核心，所以植物活細胞生長代謝等需要適當濃度的氧。但在自然界有不少植物能夠適應持續(xù)或間斷性的根際厭氧環(huán)境，如水稻和許多生長繁茂的濕生植物。水分變化常常影響植物類型與種的分布，過多的降雨與灌溉不均勻也都影響農田作物的產量。前言高等植物厭氧適應的生理及分子機制探討的問題通過遺傳改良和農藝措施怎樣克服旱生植物由于漬水造成的產量損失?濕生植物如何適應根際厭氧環(huán)境?如何解釋植物細胞的厭氧脅迫機理？探討的意義

這些研究在生態(tài)學與生產上都有一定的意義。植物細胞在感受厭氧信號后，啟動和關閉一些基因，引發(fā)一系列的生化、生理及形態(tài)結構變化，以持續(xù)個體存活。這些反應大致可以分為主動適應和被動適應兩個方面。漬水導致植物生長量及營養(yǎng)元素吸收能力的減低；某些物質如酶類，激素水平的下降等次級過程已有不少報道。本文側重于討論植物在厭氧下以緩減脅迫為目的的主動適應機制。高等植物厭氧適應的生理及分子機制1厭氧下的植物根際變化及厭氧脅迫機理

1.1根際變化

通常由于土壤漬水造成氧的迅速耗竭并引發(fā)相關的物理、化學、電化學、生物區(qū)系及土壤肥力的綜合變化。氧在水中的運動速率為空氣中的萬分之一。由于缺氧，土壤電化勢(Eh)下降，還原性金屬離子特別是Fe2+、Mn2+積累，CO2濃度升高，有機還原性物質產生。厭氧后根際微生物種群發(fā)生演變，好氣性微生物為嫌氣性微生物代替，細菌繁殖快于真菌及放線菌，植物的促生性菌根類一般受到抑制?？傊瑥闹参锔蹬c土壤關系看，厭氧除O2本身的脅迫外，還導致營養(yǎng)元素無效化，以致土壤肥力下降。高等植物厭氧適應的生理及分子機制1.2厭氧脅迫對根系生理代謝的影響以水稻為例，水稻在長期的系統(tǒng)發(fā)育過程中,在結構和功能上都形成了對少氧或缺氧環(huán)境的特殊適應能力,但長期淹灌同樣不利稻根的生長和發(fā)育。當根表氧濃度低于0.001mol/m3時,根停止伸長。鐵毒、H2S、有機酸等對稻根生長及代謝均有極大的影響,而這些有毒物質量與土壤含氧量是密切相關的。許多研究表明,缺氧提高自由氨基酸的濃度和轉變，這些自由氨基酸的增加,是由于缺氧條件下蛋白質分解和有機酸代謝改變的結果。丙氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸的積累是水稻在缺氧條件下減少酸中毒的重要因素。淹水缺氧抑制原來的蛋白質的合成產生新的蛋白質和多肽。實驗證明，玉米苗缺氧時形成兩類新的蛋白：首先是過渡多肽，后來形成厭氧多肽。后者中有一些是糖酵解酶或與糖代謝有關的酶。這些酶的出現會催化產生ATP，供應能量；也通過調節(jié)碳代謝以避免有毒物質的形成和累積。高等植物厭氧適應的生理及分子機制圖1水澇缺氧主要限制了有氧呼吸，促進了無氧呼吸，產生大量無氧呼吸產物，如乙醇、乳酸等，使代謝紊亂，受到毒害。無氧呼吸還使根系缺乏能量，阻礙礦質的正常吸收。高等植物厭氧適應的生理及分子機制圖2缺氧種子糖酵解的次要產物。糖酵解途徑可以將蔗糖轉變?yōu)榱姿嵯┐际奖?，它可以脫氫生成ATP，也可以脫羧生成草酰乙酸鹽和無機磷，丙酮酸轉換產生丙氨酸。OAA進入三羧酸循環(huán)轉變?yōu)棣?酮戊二酸或琥珀酸鹽。前者可以轉變形成谷氨酸，然后它可以脫羧生成γ-氨基丁酸鹽。高等植物厭氧適應的生理及分子機制淹水缺氧還促使植物體內形成通氣組織，例如，水稻的根和莖有發(fā)達的通氣組織，能把地上部吸收的氧輸送到根部，所以抗?jié)承跃蛷?。而小麥的莖和根缺乏這樣的通氣組織，所以對淹水脅迫的適應能力弱。但小麥、玉米等根部缺氧,也可誘導形成通氣組織。淹水缺氧之所以能誘導根部通氣組織形成，主要因為缺氧刺激乙烯的生物合成，乙烯的增加刺激纖維素酶活性加強，于是把皮層細胞的胞壁溶解，最后形成通氣組織。圖3氧氣缺乏時玉米根皮層中通氣組織的發(fā)育。圖4揚稻6號淹水4d后距根尖1.5cm處形成通氣空腔。圖5珍汕97淹水6d后距根尖1.5cm處形成大面積通氣空腔。圖6漬水10d以上小麥根成熟區(qū)皮層內均勻形成氣腔。高等植物厭氧適應的生理及分子機制1.3厭氧脅迫的生理機制植物厭氧脅迫機理的學說有6種：

能量耗竭學說；糖酵解與發(fā)酵代謝末端產物積累學說；細胞質酸化學說；厭氧后氧自由基傷害假說；土壤還原性物質毒害學說；能源物質缺乏說。高等植物厭氧適應的生理及分子機制

支持這一理論的證據有:長期耐厭氧環(huán)境的白菖(Acoruscalamus)根中積累的大量堿性氨基酸精氨酸可有效緩解胞質中pH下降；玉米乙醇脫氫酶(ADH1)缺失突變體的發(fā)酵能力減低，根細胞中pH值下降快，死亡早于野生型等。特別是Roberts用13C與31P核磁共振(NMR)法，原位測出厭氧下玉米根中細胞質與液泡中pH下降的結果支持了這一學說。

厭氧下根細胞中乳酸發(fā)酵產生初始酸化，隨之ATP水平和液泡膜上的H+-ATP酶活性下降，于是發(fā)生質子滲漏，導致細胞質酸化。一般認為這些就是細胞厭氧下死亡的主要原因。

高等植物厭氧適應的生理及分子機制

2植物厭氧適應的策略

2.1形態(tài)適應

2.1.1通氣組織的形成

通氣組織（aerenchyma）是植物薄壁組織內一些氣腔或空腔的集合。在厭氧下植物根皮層細胞常發(fā)生編程性死亡，生成通氣組織，把氧氣運送到根基部，以保證根的代謝需要，這一過程對于植物在缺氧條件下的生長具有重要的意義，是植物的一種重要的避缺氧機制。高等植物厭氧適應的生理及分子機制圖7通氣組織的形成可以不是被缺氧而是低氧刺激。ACC到乙烯的轉化需要氧的存在。乙烯產生導致根皮層細胞中一系列相關酶厭氧誘導表達，細胞液泡化，細胞壁微纖絲斷裂重接，使中皮層細胞中央貫通，形成大的通氣腔。且周圍仍有細胞質流，并不影響離子吸收和運輸。高等植物厭氧適應的生理及分子機制2.1.2形成不定根

在厭氧下許多植物初生根受到傷害或死亡，但在靠近地面處能產生許多新生的不定根。這一現象乃是由于近地表O2分壓較高所致，也可由乙烯誘導生成，但不同植物之間的差異很大。不定根產生的多寡反映了植物的適應能力，是許多旱生植物中耐漬基因型的重要標志。圖8岑樹幼苗淹水后莖的不定根和過度生長的皮孔。黑色箭頭表示淹水的深度。高等植物厭氧適應的生理及分子機制

2.1.3水生植物莖葉的延伸生長

這完全受乙烯調節(jié)，莖葉延伸可使水生植物獲得更多的光合面積，伸出水面完成生殖過程，也是避缺氧的一種機制(如深水稻或稱浮生稻)。圖9水稻秧苗對淹水深度的生長反應示意圖。秧苗在每年度洪水淹沒之前定植好。淹水可以促進節(jié)間的快速伸長和不定根的發(fā)育。一旦洪水減退秧苗的不定根會向土壤中伸長生長，生活在空氣中的植株部分向上生長。高等植物厭氧適應的生理及分子機制

2.2代謝適應

2.2.1無氧呼吸的啟動

缺氧觸發(fā)旱生植物的糖酵解過程，首先表現為乳酸脫氫酶(LDH)活性升高，乳酸發(fā)酵。當胞質中pH值達到6.8時，乙醇脫氫酶(ADH)與丙酮酸脫羧酶(PDC)被激活，迅速進入乙醇發(fā)酵途徑。無氧呼吸是植物潛在的代謝功能，當根細胞中氧濃度低于某一個閾值--稱臨界氧分壓(COP)，植物自動以還原性中間代謝產物為末端電子受體，能效率顯著降低，每分子6-碳糖，只產生2個分子ATP。它可作為一種補救途徑以維持細胞存活。物種間以及同一種不同基因型之間無氧呼吸速率有很大的差異。濕生植物除了其它適應機制以外，其無氧呼吸功能強，酶活性高，可以維持較高的能荷水平而正常生長。圖10由于缺氧的影響，糖酵解中的丙酮酸首先發(fā)酵為乳酸。高等植物厭氧適應的生理及分子機制2.2.2代謝途徑的平衡

除了糖酵解與發(fā)酵代謝外，目前發(fā)現一些耐漬類型植物在厭氧條件下還存在多條呼吸代謝途徑。這種方式能緩沖細胞質的酸化和避免單一代謝末端產物的積累。主要有以下幾種類型:琥珀酸(Suc)合成谷氨酸(Glu)轉化丙氨酸(Ala)產生蘋果酸(Mal)代謝高等植物厭氧適應的生理及分子機制2.2.3抗氧化機制的啟動

主要是一些濕生植物在自然狀態(tài)下存有較強的抵御缺氧后傷害的機能。Crawford和Braendle將這種內在機理分為誘導酶和抗氧化劑兩類。許多濕生植物中有多種抗氧化劑如抗壞血酸(Vc)、α-生育酚(VE)及谷胱甘肽(GSH)等。酶類有超氧物岐化酶(SOD)以及與抗氧化物質合成有關的脫氫抗壞血酸酶(DHAR)、單脫氫抗壞血酸還原酶(MR)等。MR能催化丙二醛(MDA)還原，DHAR則在H2O2的解毒系統(tǒng)中起作用。此外，Biemelt等最近報道，不同耐漬小麥品種之間的抗氧化劑及氧化還原酶水平有顯著差異。這說明植物厭氧下抗氧化能力發(fā)生改變具有普遍性。高等植物厭氧適應的生理及分子機制

厭氧脅迫下植物體的能量供應驟減，在此情況下植株通過收縮生長或設法增加供氧以獲得能量。這一作用是由激素行使的。厭氧下首先觸發(fā)乙烯增生，誘導通氣組織和次生根的形成，以緩解缺氧。根中CTK與GA迅速下降，根的生長速率因此下降；CTK向地上部的運輸量減少，以致整株生長速率下降。葉片中ABA積累乃是老葉合成增加的一種反映，轉運到幼葉中誘導氣孔關閉，蒸騰減少，生長受抑，老葉萎枯以適應存活。在個體水平上，由于根系厭氧的脅迫，地上部光合作用受阻，糖合成減少，因而莖葉及生殖生長均減慢。葉片在缺氧30～40min的時間內生長即減慢，如此快的反應乃是激素控制的主動調節(jié)反應。2.3細胞和個體生長發(fā)育的激素調節(jié)高等植物厭氧適應的生理及分子機制2.4植物的低氧誘導適應

有許多證據表明，旱生植物的厭氧適應能力受低氧預處理的誘導。植物種間耐厭氧性的遺傳差異乃是植物根系長期適應不同氧分壓進化的結果，濕生植物的這一適應能力強于旱生植物。同一種植物品種間的遺傳差異亦有類似的適應過程。但植物具有潛在的適應厭氧環(huán)境的能力，低氧信號能激活某些厭氧反應基因的表達，使同一種基因型的耐漬能力得到很大的改善。

Xia與Saglio通過對玉米根部控制氧濃度，研究了低氧馴化適應的可能原因。指出低氧誘導呼吸酶類(如ADH和PDC)活性升高，從而維持較高的ATP與能荷水平，且也有利于控制細胞質中pH的穩(wěn)定。有人在大田淹水及實驗室控制供氧下，研究芝麻根結構和呼吸酶活性變化的結果表明，低氧鍛煉可以誘導與根結構變化相關的基因表達，產生通氣組織與不定根，從而使根中有氧呼吸速率增加，ATP與AEC維持高水平。ADH活性雖有升高，但其升高幅度與品種耐漬強度無一致性。有關植物厭氧適應的機制可歸納如下圖。高等植物厭氧適應的生理及分子機制圖11植物耐漬適應圖解高等植物厭氧適應的生理及分子機制3植物厭氧適應的分子生物學

3.1厭氧多肽的分離鑒定3.1.1旱生植物中的厭氧多肽

Sachs首次揭示嚴格厭氧條件下旱生植物根尖合成蛋白質數量銳減的現象。他用雙向電泳技術觀察到玉米幼苗在缺氧下約有20種多肽(ANPS)，其中10種分子量較大，10種較小。對照則有90余種多肽。ANPS合成在0～1h出現，20h達到最大，此后不再增加，96h玉米幼苗死亡。此后人們相繼證明在大麥、木棉、番茄、豌豆和大豆等作物中也有類似的厭氧多肽合成模式，并發(fā)現厭氧下某些有氧蛋白的合成受抑制與多聚體的解體有關。再后10余年，人們又通過純化和測序，證明ADH、PDC、葡萄糖-6-磷酸異構酶(GPI)、淀粉合成酶(SUC)、甘油醛3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、烯醇化酶(ENO)、乳酸脫氫酶(LDH)、木葡聚糖轉葡糖苷酶(XET)及甲酸脫氫酶(FDH)等為厭氧蛋白組分。其中大多數為糖酵解與發(fā)酵代謝的調節(jié)酶，XET是細胞壁松弛有關的酶，它的轉錄子在淹水12ｈ內的玉米幼苗中有積累，表明該酶參與通氣組織的形成

。FDH在生物氧化與細胞pH穩(wěn)定中有專一的作用。高等植物厭氧適應的生理及分子機制Mujer等分離了濕生植物稗草(Echinochloacomplex)的6個種及水稻根中的厭氧蛋白，發(fā)現它們的ANPS不同于旱生植物，數量較多。根據它們產生的條件分為5類:

(1)厭氧下合成增強的9～13種；

(2)僅在厭氧下產生的1～5種；

(3)有氧無氧下均合成；

(4)有氧下合成，厭氧下抑制有3～7種；

(5)僅在有氧下合成的1～4種。除了ADH與PDC外，這些厭氧多肽鑒定的報道尚未見，這對揭示濕生植物的耐厭氧機制極為重要。

3.1.2濕生植物中的厭氧多肽

高等植物厭氧適應的生理及分子機制3.2厭氧誘導表達基因的cDNA克隆

Gerlach等在玉米上獲得第一個厭氧誘導表達基因的cDNA克隆，為乙醇脫氫酶ADH1的cDNA，全長900bp，C-端有168個氨基酸編碼區(qū)，N-端有364bp非編碼區(qū)。采用生物化學方法結合體外翻譯獲得克隆片段。Northern雜交證明乙醇脫氫酶mRNA水平在厭氧下可增加50倍。此后許多學者又在不同植物上采用不同方法，克隆出一些厭氧表達基因。其中以研究玉米最為集中，有8個厭氧基因已在染色體上定位。迄今仍然不斷有新的厭氧表達基因克隆出來。

高等植物厭氧適應的生理及分子機制3.3一些厭氧誘導表達基因的結構與功能

3.3.1乙醇脫氫酶基因Adh1和厭氧反應元件(ARE)

這一基因最早被分離出來，目前至少已在玉米、小麥、大麥、擬南芥、水稻和白菖6種植物上獲得Adh1基因全序。植物細胞中均存在兩套乙醇脫氫酶基因:一套為組成型Adh2，另一套為厭氧誘導表達型Adh1。Walker等報道玉米Adh1基因中，位于起始密碼子上游-140～-100區(qū)域是厭氧誘導表達的關鍵，稱為厭氧反應元件(ARE)。它有2個亞區(qū)，均含有GGTTT核心結構。Dennis等分析多種植物的Adh基因啟動子區(qū)核苷酸的缺失與突變時發(fā)現，當Adh1中有多個ARE時，這一基因的厭氧誘導轉錄水平成倍提高；在組成型的Adh2中亦存在ARE序列，因而認為ARE是調節(jié)蛋白結合位點，有類似增強子的作用。他們還進一步證明ARE近傍還存在一個決定轉錄的關鍵區(qū)--啟動子區(qū)(稱AREF)，它決定調節(jié)蛋白的結合與厭氧誘導表達。高等植物厭氧適應的生理及分子機制3.3.2甘油醛3-磷酸脫氫酶基因族(Gpc)

Gpc是Sachs等在對玉米厭氧多肽GAPDH與熱激蛋白HSP35的比較研究中發(fā)現的。他們用HSP35克隆檢測玉米厭氧下根組織的cDNA文庫所獲得的雜交片段，后來證明即為Gpc。目前發(fā)現有4種GAPDH基因：組成型Gpc1、Gpc2與厭氧誘導型Gpc3、Gpc4。3.3.3木葡聚糖轉葡糖苷酶(XET)相關基因

XET是一個新發(fā)現的參與胞壁代謝的重要酶。其作用是專一性切斷木葡聚糖的β-1，4-糖苷鍵，并將切下的寡聚糖鏈轉接到同類分子末端，這種現象稱為切鏈轉移作用。它對細胞壁重建和細胞擴展起重要作用。有人甚至認為它可能是植物生長機制中的核心酶。這是迄今發(fā)現的第一個與通氣組織形成相關的厭氧表達基因，意味著厭氧適應研究已在分子生物學水平上取得了新進展。3.3.4甲酸脫氫酶基因(Fdh)

FDH催化甲酸氧化為CO2，并伴隨著還原力NADH的再生，是生物氧化的末端反應之一。Suzuki等從大麥根中克隆出Fdh的cDNA，并發(fā)現這一基因的表達受缺鐵及厭氧雙重誘導。Francs認為甲酸代謝可能是存在于非光合組織中的一種尚未明確的代謝途徑。這一現象的發(fā)現把厭氧與鐵代謝聯系起來。高等植物厭氧適應的生理及分子機制3.4厭氧信號轉導

一系列厭氧反應基因隨著O2分壓的變化而迅速開啟或關閉，說明植物體內存在一個有效而精細的O2的感受和信號轉化系統(tǒng)，具體可分為兩步:第一是感受氧的變化,傳遞原初信號進而誘導乙烯的合成；第二步,通過乙烯濃度變化引起級聯反應--誘導細胞死亡。圖12在溶生通氣組織形成的過程中玉米低氧的信號轉導可導致細胞程序性死亡。有氧條件下增加Ca2+濃度的化合物可以促進通氣組織的形成，而缺氧條件下阻止Ca2+運動的化合物可以抑制通氣組織的形成。高等植物厭氧適應的生理及分子機制3.4.1血紅蛋白可能是分子氧感受體血紅蛋白作為動物體中O2的運輸工具已經得到確認。根據血紅蛋白在O2毒害與厭氧下的作用，Terwilliger認為高等植物在厭氧下由血紅蛋白感受O2分子，血紅蛋白濃度變化受O2分壓調節(jié)。

3.4.2厭氧轉錄因子HIF-1及氧自由基的調節(jié)

Semenzy與Wang分離出第一個高等生物的厭氧轉錄因子HIF-1，其與厭氧基因的結合能力和轉錄活性受低O2誘導。HIF-1結合到促紅細胞生成素(EPO)基因增強子上，即能促進其mRNA表達。但是H