紫外可見分光光度法

常用的含量測定的方法——

紫外—可見分光光度法什么是紫外—可見分光光度法？

紫外-可見分光光度法是根據(jù)物質(zhì)分子對200～760nm波長范圍的電磁波的吸收特征建立起來的光譜分析方法。其定量依據(jù)是Lambert-Beer.A=ELC紫外—可見分光光度法紫外分光光度計的構(gòu)造：紫外-可見分光光度計主要由光源、單色器、樣品室、檢測器、顯示系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成。紫外—可見分光光度法

適用對象：

被測成分本身或其顯色產(chǎn)物對可見-紫外光具有選擇性吸收。如：總生物堿、總黃酮、總蒽醌、多糖等紫外—可見分光光度法

定量方法（單組分的定量方法）：吸收系數(shù)法選用溶劑應(yīng)不干擾被測組分的測定根據(jù)Beer定律A=εcl，若L和吸光系數(shù)ε或即可根據(jù)測得的A求出被測物的濃度

例如：維生素B12的水溶液在361nm處的值為207,盛于1cm吸收池中,測得溶液濃度為

c=0.414/(207×1)=0.00200(g/100ml)紫外—可見分光光度法2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(工作曲線法)在單色光不純的情況下,測得的吸光度值可以隨所用儀器不同而在一個相當(dāng)大的幅度內(nèi)變化不定,若用吸光系數(shù)換算成濃度,則產(chǎn)生較大的誤差.但若是認(rèn)定一臺儀器,固定其工作狀態(tài)和測定條件,則濃度與吸光度之間的關(guān)系在很多情況下仍然可以是線性關(guān)系或近于線性的關(guān)系.即A=Kc紫外—可見分光光度法

2.標(biāo)準(zhǔn)曲線法(工作曲線法)但是此時K已不再是物質(zhì)的常數(shù)，不能用于定性依據(jù)。K值只是個別具體條件下的比例常數(shù)，不能互相通用。紫外—可見分光光度法3.對照法在同等條件下配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，在選定波長處，分別測量吸光度，根據(jù)Beer定律：As=EcslAx=Ecxl因是同種物質(zhì)、同臺儀器及同一波長測定，故l和E相等，所以紫外—可見分光光度法紫外—分光光度法不僅可以測定試樣中組分的含量，而且還可用于弱酸（堿）的離解常數(shù)和配合平衡常數(shù)及配合物的組成：配制分析濃度為c的弱酸溶液，分別調(diào)節(jié)溶液pH，在測定波長處測定吸光度，若在此波長處HA與A－均有吸收，則在高酸（堿）度，該酸幾乎以HA（或A－）形式存在，此時溶液吸光度分別為：AHA=εHAc或AA-=εA-c當(dāng)溶液酸度在兩者之間時，根據(jù)吸光度的加和性，則紫外—可見分光光度法

特點：相對其他光譜分析方法來說，其儀器設(shè)備和操作都比較簡單，費用少，分析速度快靈敏度高。如在紫外區(qū)直接檢測VC時，其最低檢出濃度可達(dá)到10-6g/ml.有較好的選擇性。通過適當(dāng)?shù)倪x擇測量條件，一般可在多種組分共存的體系中，對某一物質(zhì)進(jìn)行測定。精密度和準(zhǔn)確度較高。在儀器設(shè)備和其他測量條件較好的情況下，其相對誤差可減少到1%～2%。可用于對微量組分的測定用途廣泛紫外—可見分光光度法實例：分光光度法測定總姜黃素的含量材料：姜黃素對照品、姜黃醇提物（姜黃經(jīng)乙醇提取，脫脂、干燥處理而得）、姜黃素膠囊測定條件的選擇將姜黃素對照品及姜黃醇提物用乙醇溶解后，在λ200～500nm處掃描，結(jié)果可見從300nm的峰谷到500nm的峰谷止，說明姜黃醇提物在λ426nm處測定，很少或不受其他物質(zhì)干擾。見下圖1、2紫外—可見分光光度法

紫外—可見分光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精取姜黃素對照品5、10、15、20、25μl于試管中，乙醇稀釋到4.00ml搖勻，用1ml比色皿，754分光光度計λ426nm處測定吸收度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，并考察線性關(guān)系、線性范圍等。經(jīng)5次重復(fù)測定，得回歸方程：Y=0.03493X+0.0055.r=0.9998.總姜黃素濃度在1.25～6.25μg/ml范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。紫外—可見分光光度法樣品的重復(fù)性考察取同一批樣品，經(jīng)5次稱量，重復(fù)測定，結(jié)果無論是姜黃醇提物或者制劑，重復(fù)性均很好，RSD<1.50%,見下表紫外—可見分光光度法精密度考察

取同一批試液，制備5復(fù)管平行測定，結(jié)果表明，精密度良好，RSD=0.84%紫外—可見分光光度法

注意事項1.試驗中所用的量瓶和移液管均應(yīng)經(jīng)檢定校正、洗凈后使用。2.使用的