免疫組化技術(shù)概述課件

免疫組化技術(shù)概述免疫組化技術(shù)概述綱要免疫組化基礎(chǔ)抗原修復(fù)免疫組化技術(shù)概述一、免疫組化基礎(chǔ)免疫組化原理抗原、抗體免疫組化檢測的意義免疫組化技術(shù)概述免疫組化原理應(yīng)用免疫學(xué)原理—抗原抗體特異性結(jié)合，結(jié)合酶催化底物產(chǎn)生沉淀的化學(xué)方法來原位顯示組織內(nèi)抗原的存在與分布狀態(tài)。已知抗體檢測未知抗原。一項對蛋白質(zhì)進(jìn)行定位、定性及半定量研究的技術(shù)。形態(tài)學(xué)結(jié)合功能。免疫組化技術(shù)概述免疫組化原理免疫組化技術(shù)概述抗原在機(jī)體內(nèi)引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)。免疫原性：引起機(jī)體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性；反應(yīng)原性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。

免疫組化技術(shù)概述抗體機(jī)體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白。五種亞型：IgAIgEIgMIgGIgD實驗中常用抗體：單克隆抗體、多克隆抗體。免疫組化技術(shù)概述

免疫組化檢測的意義⑴惡性腫瘤的診斷與鑒別診斷；⑵確定轉(zhuǎn)移性惡性腫瘤的原發(fā)部位；⑶對某類腫瘤進(jìn)行進(jìn)一步的病理分型；⑷軟組織腫瘤的治療一般需根據(jù)正確的組織學(xué)分類，因其種類多、組織形態(tài)相像，有時難以區(qū)分其組織來源，應(yīng)用多種標(biāo)志進(jìn)行免疫組化研究對軟組織腫瘤的診斷是不可缺少的；⑸發(fā)現(xiàn)微小轉(zhuǎn)移灶，有助于臨床治療方案的確定，包括手術(shù)范圍的確定。⑹為臨床提供治療方案的選擇。

免疫組化技術(shù)概述二、抗原修復(fù)原因常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本大多用10%中性福爾馬林固定，結(jié)果使得：

（1）抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而使部分抗原決定簇被封閉了；

（2）蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。免疫組化技術(shù)概述抗原修復(fù)種類熱修復(fù)（HIER）蛋白酶修復(fù)（PIER）雙修復(fù)（特殊抗原和雙染）不修復(fù)免疫組化技術(shù)概述熱修復(fù)(HIER)的原理（主流為四個學(xué)說）“石善溶說”：固定通過改變蛋白結(jié)構(gòu)降低免疫反應(yīng)性，熱修復(fù)逆轉(zhuǎn)大部分福爾馬林導(dǎo)致的蛋白修飾，冷卻后，會重建“近天然”的結(jié)構(gòu)，免疫反應(yīng)的恢復(fù)是通過蛋白表位的復(fù)性。學(xué)說一免疫組化技術(shù)概述福爾馬林“鎖定”蛋白結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)它對熱變性作用的穩(wěn)定性?？乖迯?fù)抽提出彌散的蛋白，打開固定組織的空隙，抽提鈣-蛋白復(fù)合物，破壞部分蛋白的分子間交聯(lián)，并將有機(jī)溶劑和石蠟掩蓋的蛋白表位再水化。最終去除了蛋白的空間位阻。學(xué)說二免疫組化技術(shù)概述熱修復(fù)逆轉(zhuǎn)福爾馬林造成的交聯(lián)，進(jìn)而去除抗體滲透的阻礙，使其接近蛋白的表位。提出交聯(lián)蛋白經(jīng)高溫處理后展開，并在冷卻中得到保持，因抗原的蛋白表位大都是線性的（5~7個氨基酸殘基），一級結(jié)構(gòu)是重要的，二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)無關(guān)。學(xué)說三免疫組化技術(shù)概述福爾馬林導(dǎo)致蛋白修飾通過使蛋白的靜電荷中和，造成免疫反應(yīng)性降低。該中和作用主要是動力學(xué)效果。因此熱修復(fù)的作用是重建蛋白的靜電荷。學(xué)說四免疫組化技術(shù)概述蛋白酶修復(fù)(PIER)原理蛋白酶的消化通過破壞福爾馬林造成的蛋白交聯(lián)，實現(xiàn)抗原的修復(fù)。該方法的缺點是：破壞組織的完整性，會破壞抗原，而且酶的濃度，反應(yīng)時間，反應(yīng)溫度造成很大的差異，標(biāo)準(zhǔn)化難度較大。免疫組化技術(shù)概述抗原修復(fù)的操作熱修復(fù)（HIER）蛋白酶修復(fù)（PIER）雙重修復(fù)免疫組化技術(shù)概述熱修復(fù)（HIER）高壓修復(fù)煮沸法修復(fù)微波修復(fù)水浴加熱……免疫組化技術(shù)概述高壓修復(fù)切片先脫蠟水化將修復(fù)液注入高壓鍋，將液體煮沸放入切片（甩開水分）蓋上蓋子，等噴氣，計時1.5~2分鐘（800W~1000W）冷卻，沖洗玻片上的修復(fù)液免疫組化技術(shù)概述1.5-2min10min免疫組化技術(shù)概述煮沸法修復(fù)將修復(fù)液注入不銹鋼鍋中煮沸后，加入切片（甩干水分）用保溫檔，處理20分鐘左右冷卻，沖洗玻片上的修復(fù)液免疫組化技術(shù)概述免疫組化技術(shù)概述熱修復(fù)的特點易于實行易于標(biāo)準(zhǔn)化免疫組化技術(shù)概述蛋白酶修復(fù)（PIER）切片脫蠟水化切片上滴加酶，放入孵育盒，于37℃處理一定時間時間到，取出切片，沖洗。免疫組化技術(shù)概述雙重修復(fù)脫蠟水化后，對切片進(jìn)行胰酶消化然后，對切片進(jìn)行熱修復(fù)免疫組化技術(shù)概述抗原修復(fù)操作的注意點時間溫度冷卻免疫組化技術(shù)概述不同的修復(fù)方法對實驗結(jié)果的影響

不修復(fù)檸檬酸高溫高壓EDTA水煮胰酶消化胃酶消化一抗：RCC（PN-15）60分鐘檢測系統(tǒng)：MaxVision15分鐘顯色試劑：DAB5分鐘免疫組化技術(shù)概述不同的修復(fù)方法對實驗結(jié)果的影響

不修復(fù)檸檬酸高溫高壓EDTA水煮胰酶消化胃酶消化一抗：HBcAg

60分鐘檢測系統(tǒng)：MaxVision15分鐘顯色試劑：DAB5分鐘免疫組化技術(shù)概述不同的修復(fù)方法對實驗結(jié)果的影響

MOC-31MOC-31MOC-31MOC-31免疫組化技術(shù)概述結(jié)論正確的修復(fù)對抗體的表達(dá)十分重要抗原修復(fù)是一個個性化的方法，由抗體的克隆號，病理標(biāo)本的類型等決定。合適的修復(fù)方