《紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程》

ICS65.020.01

CCSB61

DB23

黑龍江省地方標(biāo)準(zhǔn)

DB23/TXXXX—XXXX

紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程

（征求意見稿）

主要起草單位：東北林業(yè)大學(xué)

聯(lián)系人：張含國

聯(lián)系電話/p>

郵箱：hanguozhang1@

XXXX-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

發(fā)布

黑龍江省市場監(jiān)督管理局

DB23/TXXXX—XXXX

紅松無性系SSR鑒別技術(shù)規(guī)程

1范圍

本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了利用簡單重復(fù)序列（Simplesequencerepeat,SSR）對紅松（Pinuskoraiensis）無性系鑒別

技術(shù)規(guī)程的范圍、規(guī)范性引用文件、術(shù)語和定義、儀器設(shè)備及試劑、溶液配制、引物信息、操作程序、數(shù)

據(jù)記錄與統(tǒng)計、判定規(guī)則。

本標(biāo)準(zhǔn)適用于紅松無性系的SSR指紋數(shù)據(jù)采集及品種鑒定，家系等可參考本標(biāo)準(zhǔn)。

2規(guī)范性引用文件

下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅注日期的版本適用于本文件。

凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改章節(jié)）適用于本文件。

GB/T6682中國實驗室用水國家標(biāo)準(zhǔn)

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

紅松無性系

從紅松天然群體或人工雜交、誘變?nèi)后w中，選擇優(yōu)良單株，通過無性繁殖得到的紅松品系。

3.2

參照無性系

具有SSR位點上不同等位變異的紅松無性系，用于輔助確定送檢樣品的等位變異，校正儀器設(shè)備的系

統(tǒng)誤差。

3.3

核心引物

紅松無性系鑒定中優(yōu)先選用的一套SSR引物，具有多態(tài)性高、重復(fù)性好等綜合特性。

4技術(shù)原理

由于不同紅松無性系遺傳組成不同，基因組DNA中簡單重復(fù)序列的重復(fù)次數(shù)存在廣泛差異，這種差

異可以通過PCR擴展及電泳方法進行檢測，從而能夠區(qū)分不同紅松無性系。

5儀器設(shè)備及試劑

見附錄A。

6溶液配制

見附錄B。

7引物信息

1

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核心引物名單及序列見附錄C。

8操作程序

8.1樣品制備

送檢樣品宜為一年生針葉，-80℃超低溫冷凍保存。同一紅松無性系樣品數(shù)應(yīng)大于5個。

8.2DNA提取

CTAB提取法：新鮮針葉200mg~300mg，置于研缽中，加液氮充分研磨，移入2.0mL離心管；每管

加入700μL65℃預(yù)熱的CTAB提取液后，充分混合，65℃保溫60min期間多次顛倒混勻；每管加入等體

積的三氯甲烷/異戊醇混合液，充分混合后，靜置10min；12000g離心15min后，吸取上清液至一新離心

管,再加入等體積預(yù)冷的異丙醇，顛倒離心管數(shù)次，在-20℃放置30min；4℃，12000g離心10min，棄上

清液；加入70%乙醇，旋轉(zhuǎn)離心管數(shù)次，棄去乙醇；將離心管倒立于熱有濾紙的實驗臺上，室溫干燥沉淀；

加入100μL超純水或TE緩沖液，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并進行濃度測定，稀釋至20ng/μL

充分溶解后備用。

試劑盒提取法：使用經(jīng)驗證適合SSR指紋技術(shù)的商業(yè)試劑盒，按照試劑盒的使用說明操作。

8.3PCR擴增

8.3.1引物選擇

應(yīng)選擇附錄C中核心引物進行檢測，當(dāng)檢測出不同無性系差異位點數(shù)小于2時，再選用其他引物進行

檢測；必要時進一步選擇特定標(biāo)記進行檢測。

8.3.2反應(yīng)體系

各組分的終濃度如下：DNA聚合酶0.1U/μL，dNTP0.2mmol/L，1×PCR緩沖液（含Mg2+2.5

mmol/L），樣本DNA溶液1ng/μL，正向反向引物各0.25μmol/L，其余以超純水補充至所需體積。

8.3.3反應(yīng)程序

94℃預(yù)變性3min，1個循環(huán)；94℃變性30s，51-60℃退火30s，72℃延伸15s，共35個循環(huán)；72℃

延伸7min，4℃保存。

8.4PCR產(chǎn)物檢測

8.4.1聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）

清洗玻璃板

將玻璃板反復(fù)擦洗干凈，雙蒸水擦洗2遍，95%乙醇擦洗2遍，干燥。

組裝制膠板

待玻璃板徹底干燥后組裝電泳版，調(diào)平。

灌膠

在40mL7%PAGE膠中加入TEMED和25%過硫酸銨各60μL，迅速混勻后勻速灌膠，以防出現(xiàn)氣泡，

在上部輕輕地插入梳子，使其聚合1h。

電泳

小心拔去梳子后移液器吹吸點樣孔，清除氣泡和雜質(zhì)，每一個加樣孔點入1μL混合有DNALoading

Buffer（終濃度為1×）的樣品，180V恒電壓電泳1h。電泳結(jié)束后小心分開兩塊玻璃板，取下凝膠。

注：預(yù)期擴增片段大小在150bp以下時適當(dāng)縮短電泳時間，擴增產(chǎn)物片段在300bp以上時適當(dāng)延長電泳時間，以保證

片段分離效果。

銀染

a)染色：凝膠置于染色液中水平搖動染色8min；

b)漂洗：雙蒸水快速漂洗15s;

c)顯影：凝膠置于染色液中水平搖動至帶紋出現(xiàn)；

d)漂洗：雙蒸水漂洗1min。

2

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9數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計

9.1數(shù)據(jù)記錄

將每個擴增位點的等位變異片段大小進行比較，確定樣品在該位點的等位變異；純合位點的基因型數(shù)

據(jù)記錄為X/X，雜合位點的基因型數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y分別為該位點上兩個等位變異，小片段數(shù)

據(jù)在前，大片段數(shù)據(jù)在后；缺失位點基因型數(shù)據(jù)記錄為0/0。

示例1：

樣品在某個位點上僅出現(xiàn)一個等位變異，大小為150bp，在該位點的基因型記錄為150/150。

示例2：

樣品在某個位點上有兩個等位變異，大小分別為150bp、160bp，在該位點的基因型記錄為150/160。

9.2數(shù)據(jù)統(tǒng)計

對送驗樣品進行分析時，可直接進行無性系之間的對比，如果送驗樣品某個引物位點出現(xiàn)可見的異質(zhì)

性且影響到差異位點判定時，可重新提取至少10個個體的DNA，并用該引物重新擴增，統(tǒng)計在該引物擴

增位點上不同個體的基因型(或等位變異)及所占比例。當(dāng)對送檢樣品多個個體DNA進行分析時，應(yīng)比較樣

品在各引物位點的基因型以及樣品在各引物位點的等位變異，并統(tǒng)計其在各引物位點的各種基因型(或等位

變異)及所占比例。

10判定規(guī)則

10.1結(jié)果判定

當(dāng)無性系間差異位點數(shù)≥2時，判定為“不同”；當(dāng)無性系間差異位點數(shù)=1時，判定為“近似”；當(dāng)樣

品間差異位點數(shù)=0時，判定為“相同或極近似”。

對于利用附錄C中核心引物未能檢測到≥2個差異位點的無性系，如果相關(guān)無性系存在特定標(biāo)記，可

增加特定標(biāo)記對其檢測，或篩選表中其他引物進行鑒別。

10.2結(jié)果表述

比較位點數(shù)：，比較位點為：；

差異位點數(shù)：，差異位點為：；

判定結(jié)果為：。

3

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附錄A

(規(guī)范性附錄)

主要儀器設(shè)備及試劑

A.1主要儀器設(shè)備

A.1.1PCR擴增儀。

A.1.2電泳儀：具有恒電壓、恒電流功能。

A.1.3垂直電泳槽及配套的制膠附件。

A.1.4水平電泳槽及配套的制膠附件。

A.1.5高速離心機：最大離心力大于15000g。

A.1.6水平搖床。

A.1.7電子天平：感應(yīng)為0.1mg。

A.1.8微量移液器：規(guī)格分別為2.5μL、20μL、200μL、1000μL，連續(xù)可調(diào)。

A.1.9磁力攪拌器。

A.1.10超微量分光光度計。

A.1.11微波爐。

A.1.12高壓滅菌鍋。

A.1.13水浴鍋。

A.1.14超低溫冰箱：最低溫度-80℃。

A.1.15制冰機。

A.1.16凝膠成像系統(tǒng)。

A.2主要試劑

A.2.1十六烷基三乙基溴化銨（CTAB）。

A.2.2三氯甲烷。

A.2.3異丙醇。

A.2.4異戊醇。

A.2.5乙二胺四乙酸二鈉。

A.2.6三羥甲基氨基甲烷。

A.2.7氫氧化鈉。

A.2.810×Buffer緩沖液：含Mg2+25mmol/L。

A.2.9dNTP。

A.2.10TaqDNA聚合酶。

A.2.11瓊脂糖。

A.2.12DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)。

A.2.13核酸染色劑。

A.2.14去離子甲酰胺。

A.2.15溴酚藍。

A.2.16二苯甲青。

A.2.17甲叉雙丙烯酰胺。

A.2.18丙烯酰胺。

A.2.19硼酸。

4

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A.2.20無水乙醇。

A.2.21過硫酸銨。

A.2.22硝酸銀。

A.2.23甲醛。

5

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附錄B

（規(guī)范性附錄）

溶液配制

B.1DNA提取溶液的配制

B.1.10.5mol/LEDTA溶液

186.1gNa2EDTA·2H2O溶于800mL水中，用固體NaOH調(diào)pH至8.0，定容至1L，高壓滅菌。

B.1.21mol/LTris-HCI溶液

60.55gTris堿溶于適量水中，加HCl調(diào)pH至80定容至500mL，高壓滅菌。

B.1.30.5mol/LHCI溶液

25mL濃鹽酸（36%~38%），加水定容至500mL。

B.1.4CTAB提取液

81.7g氯化鈉和20gCTAB溶于適量水中，然后加入1mol/LTrisHCl100mL，0.5mol/LEDTA40mL，

定容至1L，4℃貯存。

B.1.5TE緩沖液

1mol/LTris-HCl5mL，0.5mol/LEDTA1mL，加HCI調(diào)pH至8.0，定容至500mL。

B.2PCR擴增溶液的配制

B.2.1SSR引物

用超純水分別配制前引物和后引物終濃度均10μmol/L的工作液。

注：干粉配制前應(yīng)首先快速離心。

B.2.26×加樣緩沖液

去離子甲酰胺49mL，0.5mol/L的EDTA溶液（pH8.0）1mL，溴酚藍0.125g，二甲苯青0.125g。

B.3聚丙烯酰胺凝膠電泳溶液的配制

B.3.130%PAGE膠

丙烯酰胺290g和甲叉雙丙烯酰胺10g定容至1L。

B.3.27%PAGE膠

10×TBE緩沖液50mL，30%PAGE膠233.3mL，定容至1L。

B.3.325%過硫酸銨溶液

0.25g過硫酸銨溶于1mL超純水中。

B.3.410×TBE緩沖液

三羥甲基氨基甲烷108g，硼酸55g，0.5mol/LEDTA溶液37mL，定容至1L。

B.3.50.5×TBE緩沖液

取10×TBE緩沖液50mL，加水定容至1L。

B.4銀染溶液的配制

B.4.1染色液

稱取1g硝酸銀，加水定容至1L。

B.4.2顯影液

6

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量取1L蒸餾水中，加入15g氫氧化鈉和5mL甲醛，混勻。（甲醛現(xiàn)用現(xiàn)加）

注:除銀染溶液的配制可使用符合GB/T6682規(guī)定的三級水外試驗中僅使用確認為分析純的試劑和GB/T6682規(guī)定的一

級水。

7

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附錄C

(資料性附錄)

核心引物列表

核心引物序列及參考無性系見表C.1。

表C.1引物名單及序列信息

位點名稱引物序列預(yù)期片段大小參考無性系基因型

F:TGTTATTGCTAACGGAGATGG

ALBI_16215渤海省67215/215

R:TTTTCTATTGTAGACAGTGTCGTCTT

渤海省10138/145

F:GTGGATGCAATGAAGAAAAACAT

EPD11138-145鶴崗5138/138

R:ACGAATTGCAAAACTGCATAACT

葦青1號028140/143

F:CTAAAGGAAACTCGAAACCCTTG小北湖007142/142

EPD12140-144

R:ATGTCGATGATGATGAGGATGAT葦青2號042140/144

渤海省51150/150

F:CCTGCTAAAATTCATCTACATCCC

EPD32150-156渤海省69150/156

R:AAAGCGAGGAAAATTTGCAGTAT

葦青2號042154/156

F:AGGCTTTAGTTTTTCAAATCCCA小北湖024140/140

EPD70140-145

R:AAGTTGTTTGCTCGACTGTTAGC小北湖007140/145

小北湖007290/294

F:GAGATGAGCGAATCTGGG

P49290-294小北湖024294/294

R:TACAAGTTCCACCTACGG

鶴崗29290/290

渤海省71298/300

F:CAACATCGCCAATGACTC渤海省73302/302

P70296-302

R:CCTACCTACGCTCTGCTC渤海省92296/296

渤海省93296/298

渤海省008200/202

F:TGGGTTACCACCTTTAGC小北湖024202/208

P72200-208

R:CAATCAGAGTCTGGAGCA渤海省51208/208

葦青5號074200/208