生物化學(xué)實驗技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

生物化學(xué)實驗技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA

免疫學(xué)實驗酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

簡介：酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，簡稱酶聯(lián)免疫法，或者ELISA法。它的中心就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

基本原理：①使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性。②使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體②酶標(biāo)記的抗原或抗體③酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標(biāo)本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法在這種測定方法中有3種必要的試劑：①固相的抗原或抗體（免疫吸附劑）②酶標(biāo)記的抗原或抗體（標(biāo)記物）③酶作用的底物（顯色劑）酶聯(lián)免疫吸附劑測定法酶聯(lián)免疫吸附劑測定法注意事項：⒈正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。⒉在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：⑴固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。當(dāng)前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。⑵包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg/ml。⑶酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。⑷酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是當(dāng)前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配制，尤其是H2O2在臨用前加入。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法檢測步驟：ELISA用血清來檢測，首先血液要經(jīng)過至少半個小時的凝集，然后取血清。將酶復(fù)合物用稀釋液稀釋后，加血清及陰性、陽性對照，還有就是質(zhì)控品（這是嚴(yán)格的要求，它的范圍必須在質(zhì)控范圍內(nèi)）。經(jīng)過一個小時的孵育，然后洗板，加底物，半個小時避光反應(yīng)后加終止液即完成反應(yīng)部分，然后就是讀數(shù)。由數(shù)值來判斷結(jié)果的陰性或陽性。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法檢測方法：雙抗體夾心法雙位點一步法間接法測抗體競爭法捕獲法雙抗體夾心法雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。雙抗體夾心法雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體，則在測定時可使標(biāo)本的加入和酶標(biāo)抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。在一步法測定中，應(yīng)注意鉤狀效應(yīng)（hookeffect），類同于沉淀反應(yīng)中抗原過剩的后帶現(xiàn)象。當(dāng)標(biāo)本中待測抗原濃度相當(dāng)高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標(biāo)抗體結(jié)合，而不再形成夾心復(fù)合物，所得結(jié)果將低于實際含量。鉤狀效應(yīng)嚴(yán)重時甚至可出現(xiàn)假陰性結(jié)果。間接法測抗體

其原理為利用酶標(biāo)記的抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：⑴將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。⑵加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他抗體及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。⑶加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標(biāo)記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體。⑷加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。本法主要用于對病原體抗體的檢測而進(jìn)行傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。間接法成功的關(guān)鍵在于抗原的純度。雖然有時用粗提抗原包被也能取得實際有效的結(jié)果，但應(yīng)盡可能予以純化，以提高試驗的特異性。特別應(yīng)注意除去能與一般健康人血清發(fā)生反應(yīng)的雜質(zhì)，例如以E.Coli為工程酶的重組抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能與受過E.Coli感染者血清中的抗E.Coli抗體發(fā)生反應(yīng)?？乖幸膊荒芎信c酶標(biāo)抗人Ig反應(yīng)的物質(zhì)，例如來自人血漿或人體組織的抗原，如不將其中的Ig去除，試驗中也發(fā)生假陽性反應(yīng)。另外如抗原中含有無關(guān)蛋白，也會因競爭吸附而影響包被效果。間接法中另一種干擾因素為正常血清中所含的高濃度的非特異性抗體。病人血清中受檢的特異性IgG只占總IgG中的一小部分。IgG的吸附性很強，非特異IgG可直接吸附到固相載體上，有時也可吸附到包被抗原的表面。因此在間接法中，抗原包被后一般用無關(guān)蛋白質(zhì)（例如牛血清蛋白）再包被一次，以封閉（blocking）固相上的空余間隙。另外，在檢測過程中標(biāo)本須先行稀釋（1:40~1:200），以避免過高的陰性本底影響結(jié)果的判斷。間接法測抗體競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：⑴將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。⑵待測管中加受檢標(biāo)本和一定量酶標(biāo)抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標(biāo)本中無抗原，則酶標(biāo)抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標(biāo)本中含有抗原，則與酶標(biāo)抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標(biāo)抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標(biāo)抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標(biāo)抗原，保溫后，酶標(biāo)抗原與固相抗體的結(jié)合可達(dá)最充分的量。洗滌。⑶加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標(biāo)抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標(biāo)本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標(biāo)本中抗原含量越多。一般情況，是通過方波伏安法，檢測培養(yǎng)體系的峰電流，通過峰電流與抗原抗體的線性關(guān)系來最終確定體系的最終檢測目標(biāo)的濃度。當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競爭與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少，因此陽性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的，可直接包被固相。如抗原中會有干擾物質(zhì)，直接包被不易成功，可采用捕獲包被法，即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體，然后加入抗原，形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì)，然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競爭結(jié)合反應(yīng)。競爭法測抗體有多種模式，可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競爭結(jié)合，抗HBcELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競爭結(jié)合，洗滌后再加入酶標(biāo)抗體，與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)?？笻Be的檢測一般采用此法。捕獲法

血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定IgM抗體多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：⑴將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。⑵加入稀釋的血清標(biāo)本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。⑶加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。⑷加入針對特異性的酶標(biāo)抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。⑸加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標(biāo)本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法實驗器材和藥品：固相載體在ELISA測定過程中作為吸附劑和容器。最常用的是聚苯乙烯和聚氯乙烯。它們有較強的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來的免疫學(xué)活性。微量滴定板，量滴定板為8×12的96孔式。ELISA板的特點是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特制的比色計上迅速讀出結(jié)果。聚苯乙烯經(jīng)射線照射后，其吸附性增加。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法酶聯(lián)免疫吸附劑測定法酶結(jié)合物是酶與抗體或抗原聯(lián)結(jié)的產(chǎn)物。具有酶促反應(yīng)，顯示出生物放大作用。在ELISA中，常用的酶為辣根過氧化物酶(horseradishperoxidase,HRP)和堿性磷

酸酶(alkalinephosohatase,AP)。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法酶的底物1、HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng)。供氫體：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，最適吸收波長為492nmTMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，用HCL或H2SO4終止后，由藍(lán)色呈黃色，最適吸收波長為405nm2、AP為磷酸酯酶一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)作為底物。產(chǎn)物為黃色的對硝基酚，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)酶聯(lián)免疫吸附劑測定法陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)：陰性對照品須先行檢測，確定其中不含待測物質(zhì)。陽性對照品在含蛋白保護(hù)劑的緩沖液中加入一定量的待檢物質(zhì)，含量約為最低檢測敏感度的10~20倍。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法洗滌液常用的稀釋液為含0.05%吐溫20的磷酸鹽緩沖液。酶反應(yīng)終止液HRP反應(yīng)終止液為硫酸，一般采用2mol/LAP用NaOH終止酶聯(lián)免疫吸附劑測定法實驗方法:

1.加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育1小時。然后洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。2.加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體(經(jīng)滴定后的