2024海洋貝類片形科吸蟲PCR檢測方法

范 縮略 試 樣 安 附 PCR檢測方法，包括試劑、儀器與設(shè)備、樣品、檢測方（Fgigantica）GB/T6682GB19489-2008SN/T1193SC/T7103TAE：Tris、乙酸（Aceticacid）和EDTAITS：內(nèi)部間隔序列（InternaltranscribedEDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticSDS：十二烷基磺酸鈉（SodiumdodecylTE：Tris鹽酸和EDTA緩沖液（EDTATris-EB：溴化乙錠（EthidiumPCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerasechainTris：三羥甲基氨基甲烷（Trishydroxymethyl水：符合GB/T6682氯仿/異戊醇混合液（241）酚/氯仿/異戊醇混合液（25241）：吸蟲中380bp片段。CR檢測陽性對照為已知受片形科吸蟲感染的貝類組織樣品或添加片形科吸蟲保守序列標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒的貝類組織樣品，CR8保存。EB（10μg/μL）：按附錄A.410%SDS：按附錄A.53mol/LNaAc（pH5.0）：按附錄A.82×PremixTaqDNA聚合酶：生化試劑，-20℃V~300V）、微量移液器（0.1μL~2.5μL，0.5μL~10μL，10μL~100μL，20μL~200μL，100μL~1000μL規(guī)格）、微量移液器吸頭（1mL，200μL，1000μL規(guī)格）、2mL凍存管、1.5mL離心管、200速不小于12000rpm）。在海洋貝類產(chǎn)地或水產(chǎn)市場，按照SC/T71032mL凍存管中，液氮冷凍。電子天平稱取新鮮或冷凍樣品的勻漿組織0.05g，轉(zhuǎn)移至1.5mL加入450μL55℃水浴4h～6h，每2h顛倒離心管6～8室溫12000rpm離心20min，取上清至新的1.5mL加入等體積酚/氯仿/異戊醇混合液（25:24:1），緩慢顛倒混勻5min，12000rpm離心10min，取上層清液至新的1.5mL離心管。加入等體積氯仿/異戊醇混合液（241），緩慢顛倒混勻5min，12000rpm離心10min，取上層清液至新的1.5mL離心管。加入1/10體積3mol/L的NaAc（pH5.0，4℃保存）和等體積-20℃預(yù)冷的無水乙醇，置于-20℃沉淀DNA30min，12000rpm離心5min，棄去上清。加入100μL～150μL-20℃預(yù)冷的70%乙醇洗滌，12000rpm離心5min，小心棄去乙醇，用置于烘箱中45℃干燥15min～30min，加入適量TE緩沖液溶解DNA（TE量視DNA沉淀量而定，在30μL～100μL之間，一般為50μL），-20℃保存?zhèn)溆?。?20μL2×PermixTaqDNA10檢測引物ITS-F（1021檢測引物ITS-R（1021樣品50～100補至20伸5min；4℃保溫。40mL1.5%瓊脂糖凝膠（A.9配制。凝膠冷卻后放入電泳槽內(nèi)，在1×TAE電泳緩沖液，使液面剛剛沒過凝膠。9μLPCR1μL10DNA分子120V20min380bp380bp實驗室安全防護按GB/T19489檢測過程中防污染措施按照SN/T1193 錄0.5mol/LEDTA-Na2（乙二銨四乙酸二鈉）溶液，pH8.0EDTA-Na2H2O 186.1g滅菌去離子 8005mol/LpH8.01000mL，121℃，15min 242冰乙 57.10.5mol/LEDTA溶液 1001000mL，121℃，15min滅菌備用。1×使用。73251000.1EB（1020210SDS10010TE1MTris-Tris 6.06 40mL0.5M 9.306dd 35NaOH顆粒（1g）pH8.050mLTE1MTris- 10.5MEDTA（pH 0.2ddH2O1001MTris-HCl（pH 10.5M 20 0.5844ddH