DB51T 1362-2011 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)方法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法　　

ICS65.020.01DB51/T1362—2011黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)方法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法IDB51/T1362—2011 12規(guī)范性引用文件 1 14試劑與材料 15儀器及用具 26檢測(cè)樣品的取樣及制備 27實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn) 38結(jié)果判定與記錄 39樣品保存 3附錄A(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒基本信息 4附錄B(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢驗(yàn)程序 5本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為資料性附錄、附錄B為規(guī)范性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標(biāo)準(zhǔn)由四川省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站，成都市植物檢疫站，綿陽(yáng)市植保植檢站，江油市植保植檢站，彭州市植保植檢站。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：萬(wàn)佳、寧紅、譚家興、謝成倫、蔣輝、李耄、嚴(yán)群、劉如東、劉曉明、徐暉、黃玲、熊玉蘭。1黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)鑒定技術(shù)方法酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢驗(yàn)鑒定方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于葫蘆科作物的黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569-2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運(yùn)檢疫規(guī)程SN/T2344-2009黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)寄主廣泛，危害嚴(yán)重，是一種通過(guò)種子遠(yuǎn)距離傳播的病毒性病害。由于的粒體形態(tài)、大小等特性很難與同類病毒相區(qū)分，癥狀多樣并常有隱癥現(xiàn)象。采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法，通過(guò)CGMMV病毒蛋白抗原決定簇與相應(yīng)抗體的特異性結(jié)合，快速進(jìn)行黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗(yàn)鑒定。4試劑與材料除非另有說(shuō)明，在本標(biāo)準(zhǔn)中僅使用確認(rèn)的分析純?cè)噭┖驼麴s水或去離子水或相當(dāng)純度的水?！豢贵w(Coatingantibody)黃瓜綠斑駁花葉病毒抗體，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行。貯藏于4℃?zhèn)溆?。——酶?biāo)抗體(Antibody-enzymeconjugate)用堿性磷酸酶標(biāo)記的黃瓜綠斑駁花葉病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進(jìn)行稀釋，貯藏于4℃?zhèn)溆??！痪彌_液(Coatingbuffer)取2.93g碳酸氫鈉(NaHCOs)、1.59g碳酸鈉(Na?COs),用1000mL蒸餾水溶解，pH值為9.6,貯藏于4℃?zhèn)溆??！狿BST洗滌液(PBSTBuffer)取1.15g無(wú)水磷酸氫二鈉(NaHPO?)、0.2g氯化鉀(KC1)、0.2g無(wú)水磷酸二氫鉀(KH?PO?)、8.0g氯化鈉(NaCl)、0.5ml吐溫-20,用1000mL蒸餾水溶解，pH值為7.2?！獦悠诽崛【彌_液(Generalextractionbuffer)取20g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2.0g蛋清蛋白、1.3g無(wú)水亞硫酸鈉(Na?SO?)、0.2g疊氮化鈉(NaN?)、0.5ml吐溫-20、8g氯化鈉、0.2g磷酸二氫鈉、1.15g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，用1000mL蒸餾水溶解，貯藏于4℃?zhèn)溆??！曹椢锞彌_液(Conjugatebuffer)取0.2g牛血清白蛋白，用100mlPBST緩沖液溶解，貯藏于4℃?zhèn)溆谩?——底物(pNPP)對(duì)硝基苯磷酸二鈉——底物緩沖液(SubstrateBuffer)取0.1g氯化鎂(MgCl?)、90.39g二己醇胺(CH?CH?OH)、19.82g二己醇胺-HC1(CH?CH?OH-HC1),用1000ml蒸餾水溶8,貯藏于4℃?zhèn)洹K止液12g氫氧化鈉(NaOH)溶于100mL蒸餾水。5儀器及用具儀器及用具包括：——聚乙烯微量滴定板(40孔和96孔)?！埔浩?2μL～10μL、10μL～50μL、10μL～200μL、200μL～1000μL和1mL～5mL)?！炱?1/100g,1/1000g)。——培養(yǎng)箱?！_(tái)式高速離心機(jī)?！嘎?lián)免疫檢測(cè)儀?！欣?內(nèi)徑60mm～80mm)。——剪刀。——冰箱。——超低溫冰箱。6檢測(cè)樣品的取樣及制備6.1種子樣品種子樣品取樣數(shù)量按GB15569-2009附錄E的規(guī)定進(jìn)行，制備按SN/T2344-20094.1的規(guī)定進(jìn)行。6.2受害植株及植物產(chǎn)品在葫蘆科作物生長(zhǎng)期和結(jié)果期出現(xiàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒疑似癥狀，可整株取樣或采集植物產(chǎn)品有癥狀的部分在冷藏條件下(將樣品置于內(nèi)裝冰塊、冰袋的保溫瓶或泡沫箱中)送檢，確保樣品新鮮。病害特征參見附錄A。6.3無(wú)病害特征植株及植物產(chǎn)品沒(méi)有癥狀的葫蘆科作物植株及植物產(chǎn)品按五點(diǎn)取樣法進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)。先確定一個(gè)樣品取樣范圍的對(duì)角線中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，再在對(duì)角線上選擇四個(gè)與中心抽樣點(diǎn)距離相等的點(diǎn)作為抽樣點(diǎn)。其中，苗期小植株為整株取樣；大田高大植株為部分植株取樣，剪截植株頂部嫩梢15cm部分。抽樣數(shù)量參照表1。表1黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測(cè)取樣數(shù)量類型種植面積樣品數(shù)量苗圃2200~6004600~3000大田1注：每5個(gè)單株為一個(gè)樣，不同品種分別計(jì)算。37實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法見附錄B。如采用市售的試劑盒，按說(shuō)明操作。8結(jié)果判定與記錄——在陰性對(duì)照OD值≤0.1,且陽(yáng)性對(duì)照OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對(duì)照OD值2倍時(shí)，判定為陽(yáng)性反應(yīng)，即樣品帶CGMMV;否則判定為陰性反應(yīng)，即樣品——酶聯(lián)免疫測(cè)定需記錄酶聯(lián)板反應(yīng)原始照片及數(shù)據(jù)。9樣品保存經(jīng)檢驗(yàn)鑒定后的樣品，應(yīng)在-20℃及以下保存三個(gè)月。其中，陽(yáng)性樣品保存期4(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒基本信息A.1黃瓜綠斑駁花葉病毒分子生物學(xué)特性黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)屬于煙草花葉病毒屬 (Tobamovirus)。該病毒為正單鏈線狀RNA病毒，病毒粒體長(zhǎng)桿狀，300nm×18nm,基因組長(zhǎng)度約6.5k。該病毒含有5’端和3’端非翻譯區(qū)，5’端含帽子結(jié)構(gòu)，3’端具有一個(gè)可接受組氨酸的類似tRNA狀的結(jié)編碼區(qū)共有4個(gè)開放閱讀框，分別編碼129/186kDa,29kDa和17.3kDa共4種蛋白。A.2寄主范圍及傳播途徑——該病主要為害葫蘆科植物，寄主有黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆、筍瓜、瓠瓜、西葫蘆、棱角絲瓜、無(wú)花果葉瓜、南瓜等，是一種通過(guò)種子遠(yuǎn)距離傳播的病毒性病害?！S瓜綠斑駁花葉病毒是典型的種傳病毒，帶毒種子是其遠(yuǎn)距離傳播的主要途徑。授粉、嫁接、整枝等農(nóng)事操作，植株間接觸、汁液、花粉、灌溉水、被污染的包裝容器，以及被病殘?bào)w污染的土壤等也能傳毒，其中嫁接工具帶毒是病毒傳播的又一重要途徑。A.3病害特征黃瓜：癥狀表現(xiàn)為葉片斑駁并凸起，畸形，造成植株矮化，果實(shí)上可產(chǎn)生黃或銀色條斑，果實(shí)嚴(yán)重受損，產(chǎn)量可下降15%。西瓜：受侵染葉片輕型葉斑駁，植株矮化，果實(shí)成熟期癥狀嚴(yán)重，果實(shí)表面濃綠色圓斑，內(nèi)部出現(xiàn)果肉變色和腐爛。甜瓜：莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化癥狀減輕。瓠瓜：葉片出現(xiàn)花葉，有綠色突起，脈間黃化，葉脈呈綠帶狀。南瓜：綠脈、花葉癥狀。葫蘆：綠脈、花葉癥狀。A.4分布地區(qū)目前，發(fā)生的國(guó)家和地區(qū)有歐洲的英國(guó)、愛爾蘭、德國(guó)、荷蘭、西班牙、丹麥、瑞典、芬蘭、羅馬尼亞、匈牙利、保加利亞、捷克、波蘭、俄羅斯、摩爾多瓦、希臘；南美洲的巴西；亞洲的沙特阿拉伯、伊朗、以色列、巴基斯坦、印度、日本、韓國(guó)、朝鮮、中國(guó)(安徽省、廣東省、遼寧省、湖北省、四川省、海南省以及臺(tái)灣省)。5DB51/T1362—2011(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢驗(yàn)程序B.1包被抗體B.1.1包被37℃孵育4h。B.1.2洗板B.2點(diǎn)樣B.2.1樣品制備將待測(cè)樣品剪碎混勻后取其中1g置于研缽中，加入10mL樣品提取液充分研磨后，以一層薄棉布(或類似細(xì)棉紗)過(guò)濾樣品。在制樣時(shí)應(yīng)注意防止樣品的交叉污染。B.2.2點(diǎn)樣陰性對(duì)照和包被緩沖液空白對(duì)照。加樣完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板置于保濕容器中，4℃冰箱孵育過(guò)夜(至少16小時(shí))。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳?。B.2.3洗板在每個(gè)反應(yīng)孔加滿PBST洗滌液，迅速倒出，重復(fù)2次。洗板完成后將酶聯(lián)反應(yīng)板在紙巾上拍干。B.3結(jié)合酶標(biāo)抗體B.3.1加酶標(biāo)抗體向酶聯(lián)反應(yīng)板每孔加入100μL用