DB51T 1362-2011 黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗鑒定技術方法酶聯(lián)免疫吸附測定法　　

ICS65.020.01DB51/T1362—2011黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗鑒定技術方法酶聯(lián)免疫吸附測定法IDB51/T1362—2011 12規(guī)范性引用文件 1 14試劑與材料 15儀器及用具 26檢測樣品的取樣及制備 27實驗室檢驗 38結果判定與記錄 39樣品保存 3附錄A(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒基本信息 4附錄B(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測定法檢驗程序 5本標準附錄A為資料性附錄、附錄B為規(guī)范性附錄。本標準由四川省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標準由四川省質(zhì)量技術監(jiān)督局。本標準起草單位：四川省農(nóng)業(yè)廳植物檢疫站，成都市植物檢疫站，綿陽市植保植檢站，江油市植保植檢站，彭州市植保植檢站。本標準主要起草人：萬佳、寧紅、譚家興、謝成倫、蔣輝、李耄、嚴群、劉如東、劉曉明、徐暉、黃玲、熊玉蘭。1黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗鑒定技術方法酶聯(lián)免疫吸附測定法1范圍本標準規(guī)定了黃瓜綠斑駁花葉病毒的檢驗鑒定方法。本標準適用于葫蘆科作物的黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB15569-2009農(nóng)業(yè)植物調(diào)運檢疫規(guī)程SN/T2344-2009黃瓜綠斑駁花葉病毒檢疫鑒定方法黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)寄主廣泛，危害嚴重，是一種通過種子遠距離傳播的病毒性病害。由于的粒體形態(tài)、大小等特性很難與同類病毒相區(qū)分，癥狀多樣并常有隱癥現(xiàn)象。采用酶聯(lián)免疫吸附測定法，通過CGMMV病毒蛋白抗原決定簇與相應抗體的特異性結合，快速進行黃瓜綠斑駁花葉病毒檢驗鑒定。4試劑與材料除非另有說明，在本標準中僅使用確認的分析純試劑和蒸餾水或去離子水或相當純度的水?！豢贵w(Coatingantibody)黃瓜綠斑駁花葉病毒抗體，抗體稀釋度按市售產(chǎn)品要求進行。貯藏于4℃?zhèn)溆??！笜丝贵w(Antibody-enzymeconjugate)用堿性磷酸酶標記的黃瓜綠斑駁花葉病毒的免疫球蛋白抗體。按市售產(chǎn)品要求進行稀釋，貯藏于4℃?zhèn)溆?。——包被緩沖液(Coatingbuffer)取2.93g碳酸氫鈉(NaHCOs)、1.59g碳酸鈉(Na?COs),用1000mL蒸餾水溶解，pH值為9.6,貯藏于4℃?zhèn)溆??！狿BST洗滌液(PBSTBuffer)取1.15g無水磷酸氫二鈉(NaHPO?)、0.2g氯化鉀(KC1)、0.2g無水磷酸二氫鉀(KH?PO?)、8.0g氯化鈉(NaCl)、0.5ml吐溫-20,用1000mL蒸餾水溶解，pH值為7.2。——樣品提取緩沖液(Generalextractionbuffer)取20g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、2.0g蛋清蛋白、1.3g無水亞硫酸鈉(Na?SO?)、0.2g疊氮化鈉(NaN?)、0.5ml吐溫-20、8g氯化鈉、0.2g磷酸二氫鈉、1.15g磷酸氫二鈉、0.2g氯化鉀，用1000mL蒸餾水溶解，貯藏于4℃?zhèn)溆谩！曹椢锞彌_液(Conjugatebuffer)取0.2g牛血清白蛋白，用100mlPBST緩沖液溶解，貯藏于4℃?zhèn)溆谩?——底物(pNPP)對硝基苯磷酸二鈉——底物緩沖液(SubstrateBuffer)取0.1g氯化鎂(MgCl?)、90.39g二己醇胺(CH?CH?OH)、19.82g二己醇胺-HC1(CH?CH?OH-HC1),用1000ml蒸餾水溶8,貯藏于4℃?zhèn)洹K止液12g氫氧化鈉(NaOH)溶于100mL蒸餾水。5儀器及用具儀器及用具包括：——聚乙烯微量滴定板(40孔和96孔)?！埔浩?2μL～10μL、10μL～50μL、10μL～200μL、200μL～1000μL和1mL～5mL)?！炱?1/100g,1/1000g)?！囵B(yǎng)箱?！_式高速離心機?！嘎?lián)免疫檢測儀。——研缽(內(nèi)徑60mm～80mm)?！舻丁！??！蜏乇?。6檢測樣品的取樣及制備6.1種子樣品種子樣品取樣數(shù)量按GB15569-2009附錄E的規(guī)定進行，制備按SN/T2344-20094.1的規(guī)定進行。6.2受害植株及植物產(chǎn)品在葫蘆科作物生長期和結果期出現(xiàn)黃瓜綠斑駁花葉病毒疑似癥狀，可整株取樣或采集植物產(chǎn)品有癥狀的部分在冷藏條件下(將樣品置于內(nèi)裝冰塊、冰袋的保溫瓶或泡沫箱中)送檢，確保樣品新鮮。病害特征參見附錄A。6.3無病害特征植株及植物產(chǎn)品沒有癥狀的葫蘆科作物植株及植物產(chǎn)品按五點取樣法進行抽樣檢驗。先確定一個樣品取樣范圍的對角線中點作為中心抽樣點，再在對角線上選擇四個與中心抽樣點距離相等的點作為抽樣點。其中，苗期小植株為整株取樣；大田高大植株為部分植株取樣，剪截植株頂部嫩梢15cm部分。抽樣數(shù)量參照表1。表1黃瓜綠斑駁花葉病毒檢測取樣數(shù)量類型種植面積樣品數(shù)量苗圃2200~6004600~3000大田1注：每5個單株為一個樣，不同品種分別計算。37實驗室檢驗黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測定法見附錄B。如采用市售的試劑盒，按說明操作。8結果判定與記錄——在陰性對照OD值≤0.1,且陽性對照OD值大于陰性對照OD值2倍的前提下，樣品孔OD值大于陰性對照OD值2倍時，判定為陽性反應，即樣品帶CGMMV;否則判定為陰性反應，即樣品——酶聯(lián)免疫測定需記錄酶聯(lián)板反應原始照片及數(shù)據(jù)。9樣品保存經(jīng)檢驗鑒定后的樣品，應在-20℃及以下保存三個月。其中，陽性樣品保存期4(資料性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒基本信息A.1黃瓜綠斑駁花葉病毒分子生物學特性黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumbergreenmottlemosaicvirus,CGMMV)屬于煙草花葉病毒屬 (Tobamovirus)。該病毒為正單鏈線狀RNA病毒，病毒粒體長桿狀，300nm×18nm,基因組長度約6.5k。該病毒含有5’端和3’端非翻譯區(qū)，5’端含帽子結構，3’端具有一個可接受組氨酸的類似tRNA狀的結編碼區(qū)共有4個開放閱讀框，分別編碼129/186kDa,29kDa和17.3kDa共4種蛋白。A.2寄主范圍及傳播途徑——該病主要為害葫蘆科植物，寄主有黃瓜、西瓜、甜瓜、葫蘆、筍瓜、瓠瓜、西葫蘆、棱角絲瓜、無花果葉瓜、南瓜等，是一種通過種子遠距離傳播的病毒性病害?！S瓜綠斑駁花葉病毒是典型的種傳病毒，帶毒種子是其遠距離傳播的主要途徑。授粉、嫁接、整枝等農(nóng)事操作，植株間接觸、汁液、花粉、灌溉水、被污染的包裝容器，以及被病殘體污染的土壤等也能傳毒，其中嫁接工具帶毒是病毒傳播的又一重要途徑。A.3病害特征黃瓜：癥狀表現(xiàn)為葉片斑駁并凸起，畸形，造成植株矮化，果實上可產(chǎn)生黃或銀色條斑，果實嚴重受損，產(chǎn)量可下降15%。西瓜：受侵染葉片輕型葉斑駁，植株矮化，果實成熟期癥狀嚴重，果實表面濃綠色圓斑，內(nèi)部出現(xiàn)果肉變色和腐爛。甜瓜：莖端新葉出現(xiàn)黃斑，但隨葉片老化癥狀減輕。瓠瓜：葉片出現(xiàn)花葉，有綠色突起，脈間黃化，葉脈呈綠帶狀。南瓜：綠脈、花葉癥狀。葫蘆：綠脈、花葉癥狀。A.4分布地區(qū)目前，發(fā)生的國家和地區(qū)有歐洲的英國、愛爾蘭、德國、荷蘭、西班牙、丹麥、瑞典、芬蘭、羅馬尼亞、匈牙利、保加利亞、捷克、波蘭、俄羅斯、摩爾多瓦、希臘；南美洲的巴西；亞洲的沙特阿拉伯、伊朗、以色列、巴基斯坦、印度、日本、韓國、朝鮮、中國(安徽省、廣東省、遼寧省、湖北省、四川省、海南省以及臺灣省)。5DB51/T1362—2011(規(guī)范性附錄)黃瓜綠斑駁花葉病毒酶聯(lián)免疫吸附測定法檢驗程序B.1包被抗體B.1.1包被37℃孵育4h。B.1.2洗板B.2點樣B.2.1樣品制備將待測樣品剪碎混勻后取其中1g置于研缽中，加入10mL樣品提取液充分研磨后，以一層薄棉布(或類似細棉紗)過濾樣品。在制樣時應注意防止樣品的交叉污染。B.2.2點樣陰性對照和包被緩沖液空白對照。加樣完成后將酶聯(lián)反應板置于保濕容器中，4℃冰箱孵育過夜(至少16小時)。剩余樣品于-20℃冰箱保存?zhèn)洳椤.2.3洗板在每個反應孔加滿PBST洗滌液，迅速倒出，重復2次。洗板完成后將酶聯(lián)反應板在紙巾上拍干。B.3結合酶標抗體B.3.1加酶標抗體向酶聯(lián)反應板每孔加入100μL用