DB5101T 52-2019 鮭科魚類傳染性造血器官壞死病毒逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法　　

B50/59DB5101成都市市場監(jiān)督管理局發(fā)布IDB5101/T52-2019前言 12規(guī)范性引用文件 13試劑和耗材 14儀器和設(shè)備 2 36結(jié)果判定 4附錄A（規(guī)范性附錄）試劑配制 5附錄B（資料性附錄）IHNV的G基因的全序列（1527bp） 6DB5101/T52-2019本標(biāo)準(zhǔn)編寫按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)由成都市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草單位：成都市農(nóng)林科學(xué)院、成都市動物疫病預(yù)防控制中心、四川農(nóng)業(yè)大學(xué)。本規(guī)程主要起草人：魏文燕、汪開毓、李良玉、楊馬、劉家星、唐洪、蘇中海、楊倩、劉韜、李敏、朱玲、周瀟瀟、李俐睿、何潔、楊壯志、陳健、陳霞、鄧鈺。1DB5101/T52-2019鮭科魚類傳染性造血器官壞死病毒逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測方法本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鮭科魚類傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測的試劑耗材、儀器設(shè)備、IHNV的PCR鑒定和結(jié)果判定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于成都市行政區(qū)域范圍內(nèi)鮭科魚類IHNV的檢測鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18088-2000出入境動物檢疫采樣3試劑和耗材3.1IHNV參考毒株G基因序列參考NCBI上公布的IHNV的G基因全長參考序列（登錄號為：NC_001652）。3.2水實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682-2008，一級，并用焦碳酸二乙酯（DEPC）處理，除去DNA酶和RNA酶。3.3Taq酶-20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。3.4dNTP-20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化，濃度為10mmol/L。3.5逆轉(zhuǎn)錄酶AMV活力單位：40U/μL；-20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。3.6RNA酶抑制劑（Ranase）活力單位：40U/μL；-20℃保存，避免反復(fù)凍融或溫度劇烈變化。2DB5101/T52-20193.7.1所選取的基因編碼IHNV的糖蛋白（G基因采用一對特異性引物，擴(kuò)增目標(biāo)片段全長1527bp，濃度為40μmol/L。3.7.2上游引物F：5’-ATGGACACCATGATCACCACTCC-3’；3.7.3下游引物R：5’-TTAGGACCGGTTTGCCAGGTGATAC-3’。3.8無水乙醇分析純，使用前預(yù)冷到-20℃。3.9礦物油分析純。3.10溴酚藍(lán)3.11Trizol4℃保存。4儀器和設(shè)備4.1PCR擴(kuò)增儀。樣品臺溫度范圍：0℃~105℃;4℃保溫；溫度精度：設(shè)定溫度±0.5℃;梯度范圍：30℃~100℃;溫度均勻性：±0.5℃（孔間溫度差），在30秒內(nèi)達(dá)到目標(biāo)溫度；溫度差異范圍：1℃~25℃。4.2電泳儀。輸出范圍：0V~250V；最大功率：250W；與水平電泳槽相容；適用1%或3%瓊脂糖；適用TBE或TAE緩沖液；帶或不帶溴化乙錠。4.3紫外透射儀。紫外波長：302nm；暗箱式。4.4普通冰箱。冷凍工作溫度：-20℃;冷藏工作溫度：4℃。4.5超低溫冰箱。工作溫度：-70℃~-80℃。4.6臺式離心機(jī)。轉(zhuǎn)速范圍200rpm~12000rpm；最大離心力12000(×g轉(zhuǎn)速精度：±50r/min；溫度設(shè)置范圍：-10℃~40℃。~4.7電子天平。量程：≤120g；分度值：0.001g。4.8低溫高速離心機(jī)。3DB5101/T52-2019最高轉(zhuǎn)速：≥12000rpm；最大離心力：≥12000(×g）；溫度控制范圍：-40℃~30℃。4.9微量移液器及吸頭。規(guī)格分別為：1000μL，200μL，10μL；吸頭需無酶化處理。4.10恒溫空氣搖床。溫度范圍：4℃~40℃;控溫精度：0.1℃;工作環(huán)境溫度：10℃~30℃;定時(shí)范圍：0h~999.9h；轉(zhuǎn)速范圍：30rpm~200rpm。4.11其它耗材剪刀，鑷子（高壓滅菌處理）；離心管和PCR管（高壓滅菌處理）；組織研磨器（高壓滅菌處理）。5.1采樣5.1.1在生物安全柜中，無菌條件下進(jìn)行采樣過程。所有采集樣品均需留樣備檢?！~卵：取卵膜，100mg~200mg；——性成熟親魚：取卵巢液和精液，20μL~50μL——體長≤4cm的魚苗：取整條，若是帶卵黃囊的魚應(yīng)去掉卵黃囊，取樣≥50mg；——體長4cm~6cm的魚苗：取所有內(nèi)臟，取樣≥50mg；——體長大于6cm的魚：分別取肝、體腎、脾、頭腎，取樣≥50mg；——無癥狀的魚：分別取肝、體腎、脾、頭腎，取樣≥50mg。5.1.2各組織樣品獨(dú)立于-70℃~-80℃保存?zhèn)溆谩?.2樣品處理在生物安全柜中，無菌條件下進(jìn)行樣品處理過程。組織樣品放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，待組織變軟，再加少量液氮，再研磨，重復(fù)三次。研磨產(chǎn)物放入離心管中，再向離心管中按50mg/mL~100mg/mL加入Trizol（組織體積不能超過Trizol體積的10%），室溫放置5min，使其充分裂解（此時(shí)可放-70℃長期保存）。5.3RNA抽提對裂解液12000r/min離心5min，棄沉淀。按200μL氯仿/mLTrizol加入氯仿，振蕩混勻后室溫放置15min。4℃12000r/min離心15min。吸取上層水相，至另一離心管中。按0.5mL異丙醇/mLTrizol加入異丙醇混勻，室溫放置5min~10min。4℃12000(×g）離心10min，棄上清，RNA沉于管底。按1mL75%乙醇/mLTrizol加入75%乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀。4℃8000(×g）離心5min，盡量棄上清。室溫晾干或真空干燥5min~10min。用50μL水溶解RNA樣品，55℃~60℃,5min~10min。得到樣品可作RT-PCR模板。5.4一步法RT-PCR擴(kuò)增目的基因RNA模板5μL；5倍濃縮RT-PCR緩沖液10μL；dNTP混合物1μL；F引物和R引物各1μL；AMV反轉(zhuǎn)錄酶1μL（見附錄A.2）；MgCl22μL（見附錄A.3）；TaqDNA聚合酶1uL；RNA酶抑制劑1μL；DEPC處理4DB5101/T52-2019的水至終體積50μL。PCR參數(shù)設(shè)定：45℃30min；94℃3min預(yù)變性；94℃30s變性，60℃30s復(fù)性退火，72℃1min30s延伸，30個(gè)循環(huán)；72℃10min終末延伸；4℃保溫。5.5瓊脂糖電泳用TBE電泳緩沖液（見附錄A.4）配制1%的瓊脂糖平板（見附錄A.5）。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好淹沒膠孔。5μL樣品和2μL樣品緩沖液（見附錄A.6）混勻后加入樣品孔。在電泳時(shí)設(shè)立DNA標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量作參照。120V電泳約25min。當(dāng)溴酚藍(lán)到達(dá)四分之三膠帶時(shí)停止電泳。在紫外光照射下觀察有無DNA條帶。5.6設(shè)立對照在樣品處理過程中應(yīng)設(shè)立陽性對照（已知IHNV的RNA）、陰性對照（無病毒攜帶的健康魚組織）和空白對照（等體積水）。6結(jié)果判定經(jīng)PCR后陽性對照會出現(xiàn)一條1527bp的DNA帶。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。待測樣品PCR擴(kuò)增后未出現(xiàn)任何條帶則應(yīng)判為陰性。待測樣品PCR擴(kuò)增后能在相應(yīng)1527bp的DNA位置上出現(xiàn)條帶且將PCR產(chǎn)物送檢測序后，和已知DNA片段（見附錄B）的序列吻合度≥99%應(yīng)判定為陽性。待測樣品PCR擴(kuò)增后的條帶未處于1527bp的DNA位置上或經(jīng)測序后的序列吻合度≤99%，則需重復(fù)檢測以驗(yàn)證。5DB5101/T52-2019（規(guī)范性附錄） 試劑配制A.1純度要求標(biāo)準(zhǔn)中所有試劑，除特別注明外，全部采用分析純的試劑。A.2逆轉(zhuǎn)錄酶AMV的5倍濃縮緩沖液——Tris-HCl250mmoL/L，pH8.3；——氯化鉀（KCl）250mmoL/L；——氯化鎂（MgCl2）50mmoL/L；——DTT50mmoL/L。A.3氯化鎂溶液濃度為25mmol/L。A.4TBE電泳5倍濃縮緩沖液——Tris——硼酸（HBO3）——EDTA——水54g；27.5g；——用5mol/L的鹽酸（HCl）調(diào)pH到8.0。A.5EB（ethidiumbromide，核酸染色劑）用水配置成10mg/mL的濃縮液。用時(shí)每10mL電泳液或瓊脂中加1μL。A.6樣品緩沖液每100mL水溶液中含：溴酚藍(lán)0.25g。6DB5101/T52-2019（資料性附錄）IHNV的G基因的全序列（1527bp）B.1IHNV的G基因全序列如下：ATGGACACCATGATCACCACTCCGCTCATTCTCATTCTGATCACCTGCGGAGCAAACAGCCAAACCGTCAAACCCGACACCGCAAGCGAATCAGACCAACCCACCTGGTCAAACCCGCTCTTCACCTATCCCGAGGGATGCACTCTGGACAAGCTCTCTAAGGTCAATGCCTCTCAACTGAGATGCCCAAGGATCTTCGACGATGAGAACAGGGGGCTAATTGCCTATCCCACATCCATCCGGTCCCTGTCAGTCGGAAACGACCTCGGGGACATTCACACCCAAGGGAACCACATCCACAAAGTCCTGTACCGCACAATCTGCTCAACAGGGTTCTTCGGGGGTCAGACGATAGAGAAGGCGCTTGTAAAAATGAAACTCTCTACGAAAGAAGCAGGGGCGTATGACACCACAACCGCAGCCGCTCTGTACTTCCCAGCTCCCCGATGCCAATGGTACACCGACAACGTACAAAACGATCTCATCTTCTACTACACAACACAAAAGAGTGTTCTTAGAGATCCCTACACCAGAGACTTTCTGGACTCAGATTTTATTGGAGGAAAATGTACCAAATCACCCTGCCAGACTCATTGGTCCAACGTAGTTTGGATGGGTGATGCAGGGATACCAGCCTGTGATTCCAGCCAAGAGATAAAAGCTCACCTCTTTGTTGATAAAATCTCCAATCGAGTCGTGAAGGCAACGAGCTACGGACACCACCCCTGGGGACTGCATCAGGCCTGTATGATTGAATTCTGTGGGCAACAGTGGATACGGACAGATCTCGGTGACCTAATATCTGTCGTATACAATTCTGGATCAGAAATCCTCTCGTTCCCGAAGTGTGAAGACAAGACCGTGGGAATGAGGGGAAACTTGGATGACTTTGCCTATCTAGACGATCTGGTGAAGGCCTCTGAGAGCAGAGAGGAATGTCTTGAGGCGCACGCCGAGATAATATCAACAAACAGTGTGACTCCATACCTCCTATCCAAATTCCGATCTCCACATCCCGGAATAAATGACGTCTACGCTATGCACAAAGGCTCCATCTATCACGGGATGTGCATGACGGTCGCTGTGGACGAGGTATCCAAGGACAGGACAACGTACAGGGCCCATCGCGCTACCAGCTTCACGAAATGGGAACGACCCTTTGGGGATGAGTGGGAGGGCTTTCACGGATTGCACGGAAACAACACCACCATTATTCCAGACCTGGAGAAATACGTCGCCCAGTACAAGATGAGCATGATGGA